Objetivou-se investigar e analisar o preconceito de médicos(as), enfermeiros(as), técnicos(as) de enfermagem e agentes comunitários de saúde que atuam em Unidades Básicas de Saúde (UBS) contra usuárias lésbicas. Para tanto, foi elaborado um estudo exploratório e descritivo, de caráter transversal, com design qualitativo e amostragem não probabilística, realizado em diferentes Unidades Básicas de Saúde distribuídas entre os cinco distritos sanitários da cidade de João Pessoa, Paraíba, Brasil. Participaram do estudo 31 profissionais de saúde que, no momento da coleta, estavam trabalhando em uma das UBS visitadas. Para coleta dos dados foram utilizados um questionário sociodemográfico e a técnica do Priming, com questões posteriores ao estímulo. Como resultados, verificou-se que a desconsideração, por parte dos profissionais de saúde, da existência de situações de discriminação nos serviços de saúde, indicou a possibilidade de ocorrência de reforço na identidade social positiva do grupo. Já que ao negar a ocorrência da discriminação nos serviços em que atuam, os participantes demonstraram uma possível transformação na qualidade dos atendimentos, evitando possíveis julgamentos sociais. Percebeu-se também indicativos de preconceito sutil por parte dos participantes, já que, ao tentarem justificar a negação do direito ao atendimento em saúde às usuárias lésbicas, poderiam estar, na verdade, tentando suprimir seus próprios preconceitos em relação às usuárias. Por fim, concluiu-se que os dados obtidos podem servir de indicadores para gestores acerca da forma como profissionais de saúde concebem a saúde sexual de mulheres lésbicas, servindo de norteador para o surgimento de alternativas que favoreçam reflexões e transformações nas condutas dos profissionais.