From Blue Light to Clock Genes in Zebrafish ZEM-2S Cells

Abstract

Melanopsin has been implicated in the mammalian photoentrainment by blue light. This photopigment, which maximally absorbs light at wavelengths between 470 and 480 nm depending on the species, is found in the retina of all classes of vertebrates so far studied. In mammals, melanopsin activation triggers a signaling pathway which resets the circadian clock in the suprachiasmatic nucleus (SCN). Unlike mammals, Drosophila melanogaster and Danio rerio do not rely only on their eyes to perceive light, in fact their whole body may be capable of detecting light and entraining their circadian clock. Melanopsin, teleost multiple tissue (tmt) opsin and others such as neuropsin and va-opsin, are found in the peripheral tissues of Danio rerio, however, there are limited data concerning the photopigment/s or the signaling pathway/s directly involved in light detection. Here, we demonstrate that melanopsin is a strong candidate to mediate synchronization of zebrafish cells. The deduced amino acid sequence of melanopsin, although being a vertebrate opsin, is more similar to invertebrate than vertebrate photopigments, and melanopsin photostimulation triggers the phosphoinositide pathway through activation of a Gq/11-type G protein. We stimulated cultured ZEM-2S cells with blue light at wavelengths consistent with melanopsin maximal absorption, and evaluated the time course expression of per1b, cry1b, per2 and cry1a. Using quantitative PCR, we showed that blue light is capable of slightly modulating per1b and cry1b genes, and drastically increasing per2 and cry1a expression. Pharmacological assays indicated that per2 and cry1a responses to blue light are evoked through the activation of the phosphoinositide pathway, which crosstalks with nitric oxide (NO) and mitogen activated protein MAP kinase (MAPK) to activate the clock genes. Our results suggest that melanopsin may be important in mediating the photoresponse in Danio rerio ZEM-2S cells, and provide new insights about the modulation of clock genes in peripheral clocks.

Efeitos de glicocorticoide sobre a expressão de genes de relógio nas células ZEM-2S de Danio rerio

“…Surpreendentemente, os rins e o coração desse pequeno peixe teleósteo são diretamente fotossensíveis quando isolados em cultura, sendo sincronizados quando submetidos a ciclos claro/escuro (Whitmore et al, 1998;Whitmore et al, 2000). Tal fenômeno também se estende a linhagens embrionárias Farhat et al, 2009;Ramos et al, 2014), o que nitidamente demonstra que, primeiramente, os osciladores periféricos são dotados de fotorreceptores e, segundo, que esses relógios são independentes de um oscilador central.…”

“…No modelo adotado neste trabalho, avaliando a expressão dos cinco genes por PCR quantitativo e tendo considerado como indicador aceitável de expressão valores alcançados até 32 C T s de amplificação, apenas as Opn4m-1 e Opn4m-2 mostraram-se expressas em células ZEM-2S (Ramos et al, 2014), sugerindo que o início da expressão das outras variantes se deu em estágios mais avançados do desenvolvimento.…”

“…Consistente com isso, a observação de oscilações na expressão temporal em EE para per1b demonstra que este gene é regulado pelo relógio circadiano, denominação essa cunhada que se opõe aos genes que são induzíveis por luz, como per2, o qual responde com aumentos significativos a pulsos de luz (Ramos et al, 2014), mas não oscila em condições constantes (Cahill, 2002;Delaunay et al 2003;Vatine et al, 2011).…”

“…A distinção entre genes regulados pelo relógio ou induzidos pela luz é igualmente aplicada à família dos genes cry, em que apenas cry1a é diretamente responsivo à luz (Kobayashi et al, 2000;Ramos et al, 2014) De maneira geral, quando relógios periféricos são mantidos em cultura, ou até mesmo, relógios biológicos centrais, se dissociados (Welsh et al, 1995), exibem ritmos individuais, comportando-se cada célula na população como um relógio independente, com período e fases podendo ser distintos entre as células, o que, equivocadamente, pode em uma primeira análise, levar à interpretação de arritmicidade . Dessa forma, muito provavelmente, à maneira como ocorre no processo de sincronização, que envolve a ação de um ciclo ambiental sobre um oscilador, arrastando e ajustando-o ao seu período, mecanismos de acoplamento se desenvolvem entre os próprios osciladores, de modo a promover a comunicação entre os mesmos para que se sintonizem e expressem um padrão rítmico em comum (Golombek & Aguilar-Roblero, 2003).…”

“…Embora essa classificação permita diferenciar mais cuidadosamente a ação dos fatores ambientais, o próprio histórico de aceitação do mascaramento como um fenômeno importante e integrante do sistema circadiano dificultou e negligenciou por muito tempo a sua discriminação nos resultados de experimentos cronobiológicos (Marques & Waterhouse, 1994 Whitmore et al, 2000;Davies et al, 2011) a qual tem sido atribuída à existência de um grupo de opsinas não-visuais, as melanopsinas (Farhat et al, 2009;Cavallari et al, 2011;Ramos et al, 2014).…”