Os manipuladores são vias de potencial contaminação dos alimentos, sendo suas mãos o principal canal. Comportamentos inadequados podem resultar em contaminação ou caso de doença transmitida por alimentos. Neste contexto, o presente trabalho teve por objetivo avaliar o conhecimento em higiene das mãos e o perfil microbiológico das mãos de nove (9) manipuladores de alimentos das lanchonetes de um campus universitário de Goiânia. Um questionário composto de 15 questões foi aplicado, e, logo em seguida, realizou-se a coleta de amostras biológicas de suas mãos por método swab. Essas amostras foram submetidas a análises para observar as condições higiênico-sanitárias e microbiológicas por meio da contagem de micro-organismos. O método de plaqueamento spreader plate em meio de cultura ágar manitol salgado foi utilizado na análise de Staphylococcus aureus. Para as enterobactérias, foi utilizado o mesmo método em meio de cultura ágar EMB (Eosina Methil Blue). A contagem foi realizada segundo o método pour plate. A maioria (87%) dos participantes relatou não terem participado de capacitação, no entanto, os resultados do questionário mostraram que os manipuladores têm alguma noção e conhecimento da importância da higiene pessoal e da higiene das mãos. Nos resultados microbiológicos das amostras, foi apresentada uma condição higiênica insatisfatória das mãos. Há necessidade de se conscientizar e capacitar periodicamente tanto os manipuladores quanto os responsáveis, tendo, assim, o intuito de melhorar o comportamento e, consequentemente, o perfil microbiológico dos manipuladores, sendo, então, uma forma de prevenção de doenças transmitidas por alimentos.