Gentechnische Modifikation der Targetspezifität zytotoxischer T-Zellen - ein additiver Therapieansatz bei gynäkologischen Tumoren

Abstract

ZusammenfassungFragestellung: Das variante CD44v7/8-Epitop wird regelmäûig bei Zervixkarzinomen detektiert. Aufgrund der fehlenden Expression im Normalgewebe bietet sich dieses tumorspezifische Antigen zur Entwicklung einer spezifischen Immuntherapie an. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer selektiven Immuntherapie durch gentechnologisch modifizierte zytotoxische T-Zellen (CTLs). Methodik: Das Gen für das single chain Antikörperfragment scFv des monoklonalen Antikörpers VFF 17 wurde an das Gen der z-Kette des TCR (T-Zell-Rezeptor)-Komplexes fusioniert und in einen retroviralen Vektor inseriert. Untersuchungen erfolgten sowohl an einer etablierten murinen T-Zelllinie (Cl96) als auch an primären T-Zellen der Maus. Beide Zelltypen wurden retroviral mit dem Fusionsgenkonstrukt infiziert und Klone mit nachgewiesener Oberflächenexpression des chimären T-Zell-Rezeptors selektioniert. Die Funktionalität des chimären Rezeptors wurde in Zytotoxizitätsassays und im Maustumormodell getestet. Ergebnisse: Transduzierte Cl96-Zellen sowie primäre T-Zellen zeigten eine MHC-unabhängige und effiziente Lyse gegenüber CD44v7/8-positiven Zielzellen. Wir konnten zeigen, dass die CD44v7/8-spezifische Lyse durch die Expression des chimären Rezeptors vermittelt wird. In einem zweiten Schritt erfolgte die Untersuchung der antitumoralen Aktivität der transfizierten T-Zelllinie Cl96 in vivo. Das Wachstum xenotransplantierter CD44v7/8-exprimierender Tumoren in athymischen Nacktmäusen konnte nach der Behandlung mit gentechnologisch modifizierten T-Zellen inhibiert werden. AbstractPurpose: The variant epitope CD44v7/8 is frequently expressed on cervical carcinoma but is rarely expressed in normal cervical tissue. Therefore CD44v7/8 is a tumour specific antigen and may play a role as a promising target for tumour-specific immunotherapy. Aim of our study was to develop a selective immunotherapy by using genetically engineered cytotoxic lymphocytes (CTLs) with a v7/8 target specificity. Material and Methods: The genes coding for the single chain fragment scFv of the monoclonal antibody VFF 17 and of the zchain of the TCR (T cell receptor) complex were fused and inserted into a retroviral vector. We retrovirally transduced a well established murine cytotoxic T-cell line (CI96) and primary mouse T-cells. T-cell clones showing surface expression of the chimeric protein were selected. A cytotoxicity assay was performed to investigate the functionality of the chimeric receptor in vitro. In a second step, an animal model of immuno incompetent nude mice bearing CD44v7/8 positive tumours was used to analyse the efficiency of the recombinant T-cell receptor in vivo. Results: Transduced Cl96 cells and primary T cells showed MHC independent and efficient killing of CD44v7/8 positive target cells in vitro. The in vivo experiments in the mouse model demonstrated an efficient antitumour activity of recombinant CTLs. We showed that growth of CD44v7/8 expressing tumours can be efficiently inhibited by reprogrammed T cells. Conclusion: The in vivo efficien...

Transduction of Human T-Cells Targeting CD44v7/8-Presenting Cells

“…Die murine ecotrope retrovirale Verpackungs-Zelllinie WE/scFv(VFF 17)y:a:z [21], die das Fusion-Gen scFv(VFF 17):y:a:z exprimiert [9], wurde in DMEM (4,5 g/l Glukose), 10 % (v/v) NK, 2 mmol/l L-Glutamin, 100 g/ml Gentamycin kultiviert und mit G418 1 mg/ml selektioniert.…”

“…Die PG13-Verpackungs-Zelllinie wurde mit retroviralen Partikeln der murinen stabil transfizierten WE/scFv(VFF 17)y:a:z [9] infiziert. Stabil transfizierte PG13-Zellen wurden durch die Kultivierung mit G 418 (1 mg/ml) selektioniert.…”

“…Danach wurden die Zellen mit 3 ml Kristallviolettfixierlösung für 15 Minuten bei RT gefärbt. Als Positivkontrolle wurde ein Parallelansatz mit Cl96/scFv(VFF 17)y:a:z-Zellen, die im Zytotoxizitätstest ME-180-Zellen nachweislich lysiert haben [9], durchgeführt.…”

“…Retroviraler Gentransfer des scFv(VFF 17)y:a:z-Fusions-Gens in die Verpackungs-Zelllinie PG13 Die murine ecotrope Verpackungs-Zelllinie W/scFv(VFF 17)y:a:z [9] exprimiert das Hüllprotein des Moloney-Maus-Leukämie-Virus und ist somit in der Lage, die murine Verpackungs-Zelllinie PG13 zu infizieren. …”

“…Unsere Arbeitsgruppe konnte bereits im Maus-Modell eine 70-prozentige Wachstumsreduktion CD44v7/8-positiver Tumoren, welche mit rekombinanten zytotoxischen murinen T-Zellen gegen das CD44v7/8-Antigen behandelt wurden, zeigen [9]. Vor dem Hintergrund der erfolgreich gentechnisch modifizierten murinen T-Zellen war nun die gentechnische Modifikation primärer humaner T-Zellen zur spezifischen Erkennung (MHC-unabhängig) CD44v7/8-exprimierender Zervixkarzinomzellen Ziel dieser Arbeit.…”