Gerichtete Evolution eines enantioselektiven Enzyms durch kombinatorische multiple Kassetten-Mutagenese

Reetz, Manfred T.; Wilensek, Stephanie; Zha, Dongxing; Jaeger, Karl‐Erich

doi:10.1002/1521-3757(20011001)113:19<3701::aid-ange3701>3.0.co;2-0

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“…In einem zukunftsträchtigen Experiment wurde eine fokussierte Mutantenbibliothek durch Sättigungsmutagenese an einem Ort bestehend aus Aminosäurepositionen 160-163 direkt neben der Bindungstasche von PAL generiert (Abbildung 1). [28] [29] und es ist eine heute allgemein akzeptierte Hypothese, die in jüngster Zeit durch eine Studie von Dalby et al erneut bestätigt wurde. [30] In weiteren Versuchen berücksichtigten wir erneut den Ort 155/162 und generierten als Folge der simultanen Randomisierung zwei Mutanten mit E-Werten von 30 bzw.…”

Section: Zyklen Bei Niedriger Fehlerrate Konnten Wir Eine Mutante Mitunclassified

“…[28] Diese und andere frühe Versuche in unseren Laboratorien suggerierten, dass Randomisierung an einer Stelle gefolgt von Mutagenese durch epPCR oder erneuter Randomisierung eine nützliche Strategie zum Durchmustern des Protein-Sequenzraumes ist. [25,28] Jedoch haben wir diesen Ansatz erst einige Jahre später mit der Entwicklung der iterativen Sättigungsmutagenese (ISM) [31] 28] In ähnlicher Weise gelang uns die Umkehrung der Richtung der Enantioselektivität. So evolvierten wir (R)-selektive PAL-Mutanten mit E-Faktoren von 4-5, [9b] und kurz darauf eine Variante mit E = 30 (R).…”

Section: Zyklen Bei Niedriger Fehlerrate Konnten Wir Eine Mutante Mitunclassified

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Gerichtete Evolution stereoselektiver Enzyme: Eine ergiebige Katalysator‐Quelle für asymmetrische Reaktionen

Reetz

2010

Angewandte Chemie

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130

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Asymmetrische Katalyse spielt eine Schlüsselrolle in der modernen synthetischen organischen Chemie, wobei künstliche Katalysatoren und Enzyme die zwei wichtigsten Optionen darstellen. Die Verwendung von Enzymen in der organischen Chemie und Biotechnologie hat in der zweiten Hälfte des vergangenen Jahrhunderts stark zugenommen, oft blieb jedoch der Anwendungsbereich aus mehreren Gründen eingeschränkt. Dazu gehören begrenzte Substratakzeptanz, geringe oder fehlende Stereoselektivität, unzureichende Stabilität und manchmal Produktinhibierung. Während der vergangenen 15 Jahre wurde die genetische Technik der gerichteten Evolution so weit entwickelt und verfeinert, dass all diese Probleme angegangen und in der Regel gelöst werden können. Sie basiert auf wiederholende Zyklen von Genmutagenese, Expression und Screening (oder Selektion). Der vorliegende Aufsatz fokussiert auf gerichtete Evolution stereoselektiver Enzyme, ein fundamental neuer Ansatz zur asymmetrischen Katalyse. Der Schwerpunkt liegt auf Methodenentwicklung in dem Bestreben, diese Art der Katalysator‐Optimierung einfacher, schneller und effizienter als in der Vergangenheit zu gestalten. Die neueren Methoden bescheren dem Chemiker und dem Biotechnologen robuste und selektive Katalysatoren für eine Vielzahl von nützlichen Anwendungen.

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Section: Zyklen Bei Niedriger Fehlerrate Konnten Wir Eine Mutante Mitunclassified

Gerichtete Evolution stereoselektiver Enzyme: Eine ergiebige Katalysator‐Quelle für asymmetrische Reaktionen

Reetz

2010

Angewandte Chemie

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130

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“…Moreover, DNA shuffling of mutants obtained using epPCR at high mutation rate (three amino acid exchanges per enzyme molecule) also proved to be effective. This research not only culminated in the best mutant ( E = 51), [6] it also allowed for certain conclusions regarding improved strategies for exploring protein sequence space. These efforts are summarized in Fig.…”

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confidence: 99%

“…Such a systematization distinguishes CASTing from previous focused libraries that we and other groups had reported earlier. [2,6] CASTing was originally developed and used to expand the range of substrate acceptance of enzymes, but only epPCR at different mutation rates which resulted in E = 10.8. [14] In both cases the same number of clones were involved (20,000), which is strong evidence that ISM is more efficient than the traditional approach.…”

mentioning

confidence: 99%

Evolution in the Test-Tube as a Means to Create Selective Biocatalysts

Reetz

2007

Chimia

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The development of chiral catalysts for use in synthetic organic chemistry is traditionally associated with progress in asymmetric transition metal catalysis or organocatalysis. In addition to these options chemists have employed enzymes for a number of asymmetric transformations for a long time. However, limited substrate acceptance and insufficient enantioselectivity are the crucial factors which prevent the general exploitation of biocatalysis in organic chemistry. In order to solve this long-standing problem, we proposed some time ago the concept of directed evolution of enantioselective enzymes. This report constitutes a short overview of the principle involved, together with a description of the first examples and the illumination of the present and future challenges.

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“…absorption or fluorescence) should ease the instrumentation dependence and increase the speed of high-throughput assays. [1,10] We introduced the use of enantioselective indicator-displacement assays (eIDAs) to determine both concentration and ee of chiral samples. [11][12][13] Few other methods have been shown to have this capacity.…”

Section: Introductionmentioning

confidence: 99%

Two Methods for the Determination of Enantiomeric Excess and Concentration of a Chiral Sample with a Single Spectroscopic Measurement

Zhu

Shabbir

Anslyn

2006

Chemistry A European J

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The previously established enantioselective indicator–displacement assays (eIDAs) for the determination of concentration and enantiomeric excess (ee) require two spectroscopic measurements for each chiral sample. To further simplify the operation of eIDAs, we now introduce two innovative analytical methods, both of which utilize a dual‐chamber quartz cuvette, which reduces the number of spectroscopic measurements from two to one. An attractive feature of this cuvette is that the concentration‐ and ee‐dependent absorption data can be collected at the isosbestic points or transparent regions of the spectra recorded in each individual chamber, thereby reflecting optical changes that occur in the other chamber. Therefore, two independent equations, which are needed to solve the values of the two independent variables—concentration and ee—can be established with only a single spectroscopic measurement. The first method takes advantage of this feature in conjunction with a judicious choice of indicator/host combinations to generate concentration‐ and ee‐dependent calibration curves. Our second method removes the requirement to measure equilibrium constants and molar absorptivities altogether through the use of artificial neural networks (ANNs). The most frequently used three‐layer feed‐forward network is generated, which relates the absorption data to concentration and ee of the samples by training with a back propagation procedure. Here, the data collection is not limited to the isosbestic points or transparent regions. Both approaches enabled accurate and rapid determination of concentration and ee of chiral samples. The technology removes the relative difficulty, which is the need for two separate measurements for concentration and ee respectively, of analyzing chiral samples compared to achiral samples. When implemented in a high‐throughput format, this technology should greatly facilitate the discovery of asymmetric catalysts in the same way as conventional high‐throughput screening assays.

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Gerichtete Evolution eines enantioselektiven Enzyms durch kombinatorische multiple Kassetten-Mutagenese

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Gerichtete Evolution stereoselektiver Enzyme: Eine ergiebige Katalysator‐Quelle für asymmetrische Reaktionen

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Evolution in the Test-Tube as a Means to Create Selective Biocatalysts

Two Methods for the Determination of Enantiomeric Excess and Concentration of a Chiral Sample with a Single Spectroscopic Measurement

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