Heterologous expression and characterization of functional mushroom tyrosinase (AbPPO4)

Abstract

Tyrosinases are an ubiquitous group of copper containing metalloenzymes that hydroxylate and oxidize phenolic molecules. In an application context the term 'tyrosinase' usually refers to 'mushroom tyrosinase' consisting of a mixture of isoenzymes and containing a number of enzymatic side-activities. We describe a protocol for the efficient heterologous production of tyrosinase 4 from Agaricus bisporus in Escherichia coli. Applying this procedure a pure preparation of a single isoform of latent tyrosinase can be achieved at a yield of 140 mg per liter of autoinducing culture medium. This recombinant protein possesses the same fold as the enzyme purified from the natural source as evidenced by single crystal X-ray diffraction. The latent enzyme can be activated by limited proteolysis with proteinase K which cleaves the polypeptide chain after K382, only one The latent enzyme can amino acid before the main in-vivo activation site. Latent tyrosinase can be used as obtained and enzymatic activity may be induced in the reaction mixture by the addition of an ionic detergent (e.g. 2 mM SDS). The proteolytically activated mushroom tyrosinase shows >50% of its maximal activity in the range of pH 5 to 10 and accepts a wide range of substrates including mono-and diphenols, flavonols and chalcones.

Polymerizing Like Mussels Do: Toward Synthetic Mussel Foot Proteins and Resistant Glues

“…Tyrosinase occurs almost ubiquitously throughout nature, is commercially available at low cost, and meets requirements for materials science applications 14. To avoid batch‐to‐batch variations,15 the enzymatic reactions were carried out with the active form of a recombinantly expressed tyrosinase ( Agaricus bisporus polyphenol oxidase isoform 4, Ab PPO4) 14, 16.…”

Structure and properties of AB21, a novel Agaricus bisporus protein with structural relation to bacterial pore‐forming toxins

“…Although helical bundles are very common and found in a wide variety of proteins, we believe that the reported structure of the protein dimer, formed by locking two monomers inside each other, is unique and has not been described before. The crystallographic structure of AB21 presented here adds to the small number of structures of proteins from A. bisporus that have been determined so far, namely the lectin ABL, mannitol 2‐dehydrogenase, tyrosinases abPPO3, abPPO4, and the tyrosinase‐binding protein MtaL …”

Eine peptidvermittelte Selbstspaltungsreaktion initiiert die Tyrosinaseaktivierung

“…[1,2] PPOs treten in Archaeen, Bakterien, Pilzen, Pflanzen und Tieren auf. [7][8][9][10] Konkret werden pflanzliche PPOs als Proenzyme (55-65 kDa) exprimiert, die aus einer enzymatisch aktiven (40-45 kDa) und einer C-terminalen Domäne (15)(16)(17)(18)(19) bestehen. [7][8][9][10] Konkret werden pflanzliche PPOs als Proenzyme (55-65 kDa) exprimiert, die aus einer enzymatisch aktiven (40-45 kDa) und einer C-terminalen Domäne (15)(16)(17)(18)(19) bestehen.…”

“…[13] PPOs werden im Allgemeinen durch die Entfernung ihrer C-terminalen Domäne aktiviert. [12,15] Apfel-und Champignon-Tyrosinasen kçnnen in vitro durch die Verwendung gebräuchlicher Proteasen aktiviert werden, [16,17] jedoch wurde in beiden Fällen die C-terminale Domäne nicht spezifisch abgespalten, sondern von den jeweiligen Proteasen (Trypsin und Proteinase K) vollständig verdaut. [14] Es wird generell angenommen, dass pro-PPOs durch eine proteolytische Reaktion, auf die die Ablçsung der C-terminalen Domäne vom aktiven Protein folgt, aktiviert werden.…”

“…Der In-vivo-Aktivierungsmechanismus ist mit Ausnahme von drei Insekten-PPOs,d ie durch eine komplexe Kaskade von Serinproteinasen aktiviert werden, jedoch noch weitgehend unbekannt. [16][17][18] Es wird angenommen, dass das Detergens strukturelle Veränderungen innerhalb des Enzyms induziert, wodurch das aktive Zentrum fürankommende Substrate zugänglicher wird. [12,15] Apfel-und Champignon-Tyrosinasen kçnnen in vitro durch die Verwendung gebräuchlicher Proteasen aktiviert werden, [16,17] jedoch wurde in beiden Fällen die C-terminale Domäne nicht spezifisch abgespalten, sondern von den jeweiligen Proteasen (Trypsin und Proteinase K) vollständig verdaut.…”