Heterologous expression of Neurospora crassa cbh1 gene in Pichia pastoris resulted in production of a neutral cellobiohydrolase I

Abstract

The high production cost of cellulase is one of the limitations that hinder the commercialization of lignocellulose-based biorefineries. As one of the important cellulases, Neurospora crassa cellulase is not so intensively investigated as T. reesei cellulase.In this study, the cbh1gene (NCU07340) cloned from N. crassa was expressed in Pichia pastoris under the control of alcohol oxidase 1 (AOX1) promotor. Six transformants with the highest resistance to G418 were selected by two rounds of transformant screening, among which the most robust producer of the recombinant cellobiohydrolase I (CBHI) has an Avicelase activity of 0.22 U/mL. After fermentation optimization, it was improved to 0.30 U/mL. Interestingly, the optimal temperature and pH of the recombinant CBHI were 60 C and 7.2, respectively, and it was quite stable within the wide ranges of temperature and pH. This work is a good example for the future improvement and optimization of N. crassa cellulase.

Eukaryotic Expression of the Cytochrome c Oxidase Subunit I of Sitophilus zeamais and Its Interaction with Allyl Isothiocyanate

“…Because the circular plasmid cannot be transcribed and translated in eukaryotic cells such as yeast, it is necessary to linearize the recombinant plasmid and integrate it into the genomic DNA of yeast cells . In methanol-inducible expression vectors such as pPICZαA and pPIC9K, the AOX1 gene is used as the promoter of P AOX1 , and a restriction site (such as Sac I) located in the strong promoter is selected to connect the foreign gene downstream of the P AOX1 strong promoter to obtain high expression. ,, Therefore, in order to integrate the recombinant plasmid into the yeast genome, the recombinant plasmid was linearized by Sac I. The linearized recombinant plasmid was transformed into GS115 yeast competent cells by electroporation.…”

Clonagem, expressão e caracterização de três enzimas hidrolíticas de >i<Aspergillus fumigatus>/i< envolvidas na desconstrução de bagaço de cana-de-açúcar

“…Particularmente no caso da xilana, a desconstrução da cadeia principal a monômeros de Dxilose pode ser alcançada mediante a catálise por endo-1,4-β-xilanases e β-xilosidases (MÉNDEZ-LÍTER et al, 2021). As xilanases desempenham um papel fundamental nesse processo, uma vez que promovem o ataque inicial às ligações glicosídicas presentes no interior desse polímero, convertendo-o em xilooligossacarídeos (XOs) com diferentes graus de polimerização (CHEN et al, 2019a;HAN et al, 2019;HAQ & AKRAM, 2019;YANG et al, 2019;EVANGELISTA et al, 2018;AN et al, 2015).…”

“…Xilanases GH11, por exemplo, geralmente apresentam eficiências catalíticas superiores, além de valores de pI mais elevados e pesos moleculares menores que 30 kDa. Por outro lado, foi reportado que xilanases GH10 exibiram melhores desempenhos quando associadas a celulases durante a degradação de biomassas; somado a isso, essas enzimas costumam exibir maiores termoestabilidade e versatilidade catalítica (ou seja, possuem a habilidade de atuar em uma maior variedade de substratos ou, mais especificamente, em xilanas com diferentes graus e tipos de substituição), sendo, portanto, alvos muito interessantes para propósitos industriais (MÉNDEZ-LÍTER et al, 2021;JOSHI et al, 2020;YANG et al, 2020;HE et al, 2019;YANG et al, 2019;HU & SADDLER, 2018;MAITAN-ALFENAS et al, 2016;van GOOL et al, 2013).…”

“…Essa levedura se destaca por ser metilotrófica, ou seja, capaz de crescer em um meio de cultura contendo metanol como única fonte de carbono, sendo esse um substrato simples e barato (YANG et al, 2019;CEREGHINO & CREGG, 2000). Essa habilidade é atribuível à hiperexpressão de enzimas envolvidas no metabolismo do metanol quando as células de levedura são cultivadas na presença desse composto, e é justamente a base conceitual do sistema de expressão de P. pastoris (CEREGHINO & CREGG, 2000).…”

“…O forte promotor da AOX1 (PAOX1) é altamente regulado por dois mecanismos (um de repressão/desrepressão e um de indução): o mesmo é fortemente reprimido quando P. pastoris é cultivada na presença de glicose, glicerol ou etanol, e, uma vez esgotadas essas fontes de carbono do meio, é desreprimido; contudo, a expressão do gene AOX1 só é induzida após a adição de metanol (ALI et al, 2020;CHAHED et al, 2018;AHMAD et al, 2014;CEREGHINO & CREGG, 2000). Desse modo, a inserção de genes exógenos no genoma de P. pastoris por recombinação homóloga no lócus PAOX1 constitui um dos métodos mais considerados pelos pesquisadores, uma vez que possibilita que grandes quantidades das proteínas recombinantes de interesse (na faixa de miligramas a gramas) sejam expressas, de forma facilmente regulada, a um baixo custo (ALI et al, 2020;YANG et al, 2019;CHAHED et al, 2018;MAITAN-ALFENAS et al, 2016;MACAULEY-PATRICK et al, 2005).…”