High-Throughput Quantitative Polymerase Chain Reaction in Picoliter Droplets

Kiss, Margaret M.; Ortoleva-Donnelly, Lori; Beer, Neil Reginald; Warner, Jason; Bailey, Christopher G.; Colston, Bill W.; Rothberg, Jonathon M.; Link, Darren R.; Leamon, John H.

doi:10.1021/ac801276c

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“…Among these methods are Agilent's SureSelect in-solution hybrid capture method (8 ), RainDance Technologies' microdroplet PCR-based enrichment (9 ), and Febit's microfluidicsbased HybSelect technology (10 ). The Agilent and Febit methodologies for sequence capture are similar to NimbleGen arrays in that they rely on hybrid selection, whereas the RainDance methodology is a highly multiplexed PCR reaction.…”

Section: Discussionmentioning

confidence: 99%

Evaluation of Oligonucleotide Sequence Capture Arrays and Comparison of Next-Generation Sequencing Platforms for Use in Molecular Diagnostics

Hoppman-Chaney¹,

Peterson²,

Klee

et al. 2010

Clinical Chemistry

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Evaluation of Oligonucleotide Sequence Capture Arrays and Comparison of Next-Generation Sequencing Platforms for Use in Molecular Diagnostics

Hoppman-Chaney¹,

Peterson²,

Klee

et al. 2010

Clinical Chemistry

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“…Des systèmes basés sur l'IVC ont également été appliqués à la mise en évidence d'ADN oncogènes circulants dans les selles et le plasma [37]. Toutefois, ce n'est que récemment que la PCR digitale a été réalisée en microfluidique en gouttes de quelques picolitres [21,22,23], offrant ainsi une nouvelle dimension au développement de systèmes diagnostiques. La microfluidique en gouttes permet également l'encapsulation contrô-lée et l'analyse à haut débit de micro-organismes.…”

unclassified

Gouttes et émulsions

et al. 2009

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La miniaturisation a été l'une des étapes déterminantes contribuant à l'avancée des technologies. En électronique et en informatique, par exemple, le nombre de transistors par microprocesseur a doublé tous les deux ans depuis 1961 (phénomène connu sous le nom de Loi de Moore) jusqu'à atteindre 1,7 milliards de transistors en 2008 pour l'Intel Itanium, qui fonctionne à 2 GHz, procurant une puissance informatique en croissance continue. En biologie et en médecine, la miniaturisation a été plus limitée : les systèmes robotisés, utilisés dans l'industrie pharmaceutique pour le criblage de composés chimiques en microplaques, ont permis une réduction de la taille des échantillons analysés jusqu'à des volumes de l'ordre du microlitre et des cadences d'environ un test par seconde avec des plaques de microtitration. Mais cette technologie est sur le point d'atteindre ses limites [1]. Les changements d'échelle liés à la diminution des volumes ou à l'augmentation des cadences font apparaître des barriè-res intrinsèques : d'une part, les systèmes mécaniques tels que les robots ne sont pas facilement miniaturisables, et d'autre part, la manipulation des liquides à des échelles submillimétriques (1 μL correspond à une goutte de 1 mm de diamètre) est limitée par l'évaporation relativement rapide des liquides (eau ou solvants) et les effets de surface. Il est donc clair que seul un changement technologique permettra de franchir le pas de la miniaturisation. Nous présentons dans cette revue les progrès récents qui permettent de réaliser des tests biologiques quantitatifs dans des microréacteurs de quelques picoL à quelques nanoL, à un très haut débit (plusieurs milliers de tests par seconde). Ces systèmes sont susceptibles, à terme, d'offrir une alternative robuste et efficace aux tests tels qu'ils sont pratiqués actuellement dans les laboratoires. Ces progrès, que désigne l'appellation « microfluidique en gouttes », sont basés sur le couplage de deux technologies complémentaires : la microfluidique [2] et la compartimentation in vitro [3]. La première permet la manipulation contrôlée de liquides à l'échelle submillimétrique -gouttes d'une émulsion -, la seconde permet de réaliser des tests biologiques dans les gouttes d'une émulsion d'eau-dans-l'huile. La combinaison des deux permet un changement d'échelle majeur dans la miniaturisation des tests, rendant possible la réalisation de tests quantitatifs sur des volumes faibles (quelques pL) et à très haut débit (1 000 par seconde).

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“…Dans ce système, le signal de chaque goutte peut être quantifié en dépit de la forte densité de gouttes dans le réservoir, permettant ainsi d'atteindre une sensibilité de moins de dix copies d'ADN cible de Chlamydia (ADN matrice synthétique de 150-300 bp) par échantillon de 50 μL. Kiss et al ont développé un système permettant le thermocyclage et l'analyse dynamique des gouttelettes en flux continu, assurant un suivi en temps réel des produits d'amplification [30]. Cette technique offre la possibilité de détecter une molécule cible à une concentration de 0,003 pg/μL (une molécule d'ADN viral provenant du vecteur pAdeasy-1 parmi 167 gouttelettes).…”

Section: Applications Biomédicales De La Pcr Digitaleunclassified

PCR digitale en micro-compartiments

et al. 2015

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> La détection efficace d'altérations génétiques dans les domaines de la cancérologie, de la virologie ou du diagnostic prénatal requiert des niveaux de sensibilité et de spécificité hors de portée des technologies conventionnelles. En réalisant l'amplification de molécules d'ADN uniques dans des compartiments indépendants, la PCR digitale (dPCR) en systèmes microfluidiques permet de dépasser ces limitations et de suivre ces marqueurs dans les fluides biologiques. Après une présentation non exhaustive des technologies disponibles, cette revue pré-sentera leur impact potentiel pour des applications biomédicales, notamment dans la prise en charge des patients atteints de cancers. < De la PCR quantitative à la PCR digitaleDe nombreuses techniques ont été appliquées à la détection d'altéra-tions génétiques dans les tumeurs. Le choix de la technique employée repose sur un compromis entre divers critères : le coût, la sensibilité, la disponibilité et l'adéquation avec le type d'échantillon analysé (Figure 1). De nos jours, une des méthodes les plus couramment utilisées en recherche clinique pour la détection de mutations est la discrimination allélique par PCR quantitative (qPCR). Cette méthode permet l'amplification de molécules d'ADN présentes dans un échantillon et le suivi de cette amplification en temps réel [2, 3] avec une sensibilité entre 1-10 %. Cette sensibilité autorise l'analyse de tissus tumoraux, dans lesquels la proportion de clones mutants est très élevée, mais reste insuffisante pour la détection de variants rares ou celle d'ADN tumoral circulant extrait d'effluents biologiques, incluant le plasma. Ces applications nécessitent en effet de nombreuses optimisations de la méthode conventionnelle de qPCR afin d'augmenter sa sensibilité et de détecter efficacement les séquences cibles [4]. Ainsi, la détection et la caractérisation d'altérations génétiques sous représentées au sein d'échantillons biologiques complexes (sang, urine, selles, etc.) représentent un défi particulier pour la qPCR. En effet, ces séquences spécifiques de tumeurs sont très diluées au sein de séquences très proches (elles ne différent dans certains cas que

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High-Throughput Quantitative Polymerase Chain Reaction in Picoliter Droplets

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