Identificação de proteases produzidas pelo fungo entomopatogênico Beauveria bassiana (Bals) Vuill. Cepa CG432 previamente ativada em insetos vivos de broca do café ((Hypothenemus hampei))

Abstract

Identificação de proteases produzidas pelo fungo entomopatogênico ResumoConídios de fungos entomopatogênicos atravessam o exoesqueleto do inseto pela ação mecânica do tubo germinativo e produção de múltiplas isoformas de proteases, quitinases e lipases em resposta à composição da cutícula do inseto. Desta forma o objetivo deste trabalho foi extrair, purificar e caracterizar a estrutura de proteases produzidas em cultivo submerso por Beauveria bassiana CG432 previamente ativada em adultos vivos de broca-do-café (Hypothenemus hampei). Uma suspensão contendo 10 6 conídios ativados/mL foi inoculada em meio de cultura líquido a 28ºC, 150 rpm por 3 dias. O extrato de proteases (EP) foi obtido da centrifugação a 8000 g por 20 minutos, fracionado e concentrado por ultrafiltração em membrana de porosidade controlada 100 kDa e 3 kDa, respectivamente. A cromatografia de gel filtração em Sephadex G-100 separou um pico proteico (Pico II) que apresentou 56% de resíduos do aminoácido ácido aspártico quando analisado por HPLC em coluna de fase reversa ODS-C18; atividade específica 43 vezes superior ao EP sobre soro albumina bovina; atividade de protease tipo-subtilisina e uma única banda proteica revelada por nitrato de prata e Coomassie Brilhant Blue em zimograma sobre gelatina por eletroforese PAGE em condições nativas. A homogeneidade do Pico II foi confirmada pela revelação de uma única banda durante a determinação do pH isoelétrico igual a 4,5, porém a determinação da massa molecular separou 2 bandas de 23 e 26 kDa por eletroforese PAGE-2D. As proteases foram caracterizadas como serino proteases com resíduo cisteína importante para a atividade, pois foram inibidas por fluoreto fenil-metil-sufonil e ácido p-cloromercúriobenzóico. As proteases do Pico II apresentaram Km 4x10 -4 sobre substrato tipo-subtilisina.

Susceptibility of Alabama argillacea and Chrysodeixis includens (Lepidoptera: Noctuidae) larvae to Beauveria bassiana associated with kaolin

“…The insect cuticle is mainly composed of chitin with proteins, acting as a primary barrier against pathogens (Goettel et al, 2005;Xue et al, 2014). Beauveria bassiana produces chitinases and proteases to disintegrate the insect cuticle, but its efficacy depends on the spore size, conidia germination rate and metabolite production (Varea et al, 2012;Sree and Varma, 2015) and the composition of free fatty acids in the cuticle of the insects (Sree and Varma, 2015;Wronska et al, 2018). Long-chain fatty acids such as capric, undecanoic, stearic and oleic do not prevent B. bassiana conidia germination, but they may cause germ tube autolysis, preventing hyphae growth.…”