Improved Double-Nicking Strategies for COL7A1-Editing by Homologous Recombination

Abstract

Current gene-editing approaches for treatment of recessive dystrophic epidermolysis bullosa (RDEB), an inherited, severe form of blistering skin disease, suffer from low efficiencies and safety concerns that complicate implementation in clinical settings. We present a strategy for efficient and precise repair of RDEB-associated mutations in the COL7A1 gene. We compared the efficacy of double-strand breaks (induced by CRISPR/Cas9), single nicks, or double nicks (induced by Cas9n) in mediating repair of a COL7A1 splice-site mutation in exon 3 by homologous recombination (HR). We accomplished remarkably high HR frequencies of 89% with double nicking while at the same time keeping unwanted repair outcomes, such as non-homologous end joining (NHEJ), at a minimum (11%). We also investigated the effects of subtle differences in repair template design on HR rates and found that strategic template-nicking can enhance COL7A1-editing efficiency. In RDEB patient keratinocytes, application of double-nicking led to restoration and subsequent secretion of type VII collagen at high efficiency. Comprehensive analysis of 25 putative off-target sites revealed no off-target activity for double-nicking, while usage of Cas9 resulted in 54% modified alleles at one site. Taken together, our work provides a framework for efficient, precise, and safe repair of COL7A1, which lies at the heart of a future curative therapy of RDEB.

Context-Dependent Strategies for Enhanced Genome Editing of Genodermatoses

“…A repair template, including a longer homology wild-type sequence and therefore covering more mutations sites, would result in several different not predictable HR events, which would even lower the already limited HR efficiency. So far, such personalized gene editing approaches via HR have been performed in cells isolated from XP, EBS and RDEB patients showing the potential to correct autosomal dominant as well as autosomal recessive diseases [47][48][49][50][51].…”

Ex-vivo-Stammzellgentherapie an der Haut

“…Generell ist bei allen Gentherapiewerkzeugen, die das Erbgut verändern, äußerste Vorsicht geboten, und es bedarf vorab einer gründlichen Sicherheitsanalyse der generierten Reparaturmoleküle. Gerade bei Nukleasen ist bekannt, dass diese auch an ungewünschten Orten im Erbgut (oder Genom) schneiden können [7,12,13,24,25]. Aus diesem Grund wird aktuell intensiv am Einsatz potenziell sicherer Nukleasen [12,13,20] bzw.…”

“…Gerade bei Nukleasen ist bekannt, dass diese auch an ungewünschten Orten im Erbgut (oder Genom) schneiden können [7,12,13,24,25]. Aus diesem Grund wird aktuell intensiv am Einsatz potenziell sicherer Nukleasen [12,13,20] bzw. an sensitiveren Analysemethoden [23,25] gearbeitet, um diese möglichen Nebenwirkungen, auch Off-Targets genannt, im Erbgut aufspüren zu können.…”

“…TALENs sowie die CRISPR/Cas9-Nukleasen wurden bereits für therapeutische Ansätze für ausgewählte Genodermatosen als Geneediting-Werkzeuge ausgewählt. Darunter fallen die monogenetischen Hauterkrankungen EB [1,3,10,12,13], epidermolytische Palmoplantarkeratose [14] oder epidermolytische Ichthyose [15]. Gene-Editing mittels Designer-Nukleasen ermöglicht einerseits die Deletion von Genen, in denen eine dominantnegative Mutation den Phänotyp am Patienten verursacht [1,15], aber auch die potenziell spurenlose Reparatur von Mutationen über die sog.…”

“…Gene-Editing mittels Designer-Nukleasen ermöglicht einerseits die Deletion von Genen, in denen eine dominantnegative Mutation den Phänotyp am Patienten verursacht [1,15], aber auch die potenziell spurenlose Reparatur von Mutationen über die sog. homologe Rekombination (HR) [10,12,13].…”