In vivo evolutionary engineering of riboswitch with high-threshold for N-acetylneuraminic acid production

Advanced strategies and tools to facilitate and streamline microbial adaptive laboratory evolution

“…Beyond that, the high-throughput method combining FACS and next-generation sequencing has also been applied to profile large biosensor libraries in parallel [143], accelerating the speed of obtaining genetic biosensor variants with ideal response curves. Additionally, genetic biosensor-guided ALE has recently been utilized to engineer the response performance of biosensors [144]. This application belongs to the engineering of biomolecules and is therefore not included in the main text for microbial ALE, as well as other studies for pure knowledge mining and protein evolution.…”

Engineering Escherichia coli for highly efficient production of lacto-N-triose II from N-acetylglucosamine, the monomer of chitin

“…The shake flask fermentation medium called GlcNAc-defined medium I was prepared and slightly modified from previous studies [ 40 ]. The GlcNAc-defined medium I was composed of 20 g L −1 GlcNAc, 10 g L −1 yeast extract, 13.5 g L −1 KH 2 PO 4 , 4.0 g L −1 (NH 4 ) 2 HPO 4 , 1.7 g L −1 citric acid, 1.4 g L −1 MgSO 4 ·7H 2 O, 4.5 mg L −1 thiamine, and 10 mL L −1 trace element solution.…”

合成生物学应用于微生物群体感应的研究进展

“…QS 是细菌通讯的一种形式，合成生物学利用这一组合的元件构建了许多典型的基因电路，包括 基于 QS 的周期振荡器、触发开关和逻辑门。随着新的基因电路的不断增加，扩展了更多复杂的合 成 QS 菌群和通讯网络，但这些合成感应电路的可靠性需要仔细评估。在众多的评价参数中，信道 容量是评价所有通信系统性能的一项重要指标，它是指在特定情况下系统所能输入和输出的最大信 息量。一种基于细菌的分子通讯方法：双端模型，通过分析由 3 个菌群构成的合成逻辑电路的质量 和信道容量，对合成感应电路的性能进行了有效评估 [63] 。该模型是一个集成的合成电路，由上级通 路完成产生的信号激发下级通路的运行，这个模型借助纳米级的膜，在水环境中只允许两个输出端 的信号分子通过，这样就能使不同信号结合的多种细菌并行结合特定的信号 [63] 。合成通信系统的质 量决定了 QS 过程的发展方向和感应电路的性能。在细菌的合成逻辑门中，系统接收环境信号作为 分子输入，通过一系列合成遗传电路和自由扩散的通道作为分子输出 [62,64] 。在这一过程，环境分子 信号的延迟、分子振幅的差异都会改变电路的精度、召回率及假阳性率，进而影响合成感应电路的 性能和质量 [63] 。除了信道容量，其它参数如拨动开关、逻辑门等也经常用于表征通信系统性能的指 标 [63,65] 3.1 拨动开关 生物工程的主要目的是利用多基因重组技术来提高目标产物的产量，传统的方式主要是基因敲 除和过表达， 但这两种方式可能会损害菌体的生长状况 [66,67] 。 拨动开关是解决这一问题的有利工具， 它可以实现特定基因的适时激活和关闭，可用于合成基因线路中提高目标产物的产量 [68] 。最典型的 例子是 Gu 等 [69] 构建的 aroK 拨动开关， 它可以精准控制大肠杆菌莽草酸酯合成途径中蛋白活性和关 键酶的表达，减少不必要的能量消耗，最终使野生型大肠杆菌分泌莽草酸产量高达 13.15 g/L，成功 构建了基于拨动开关的营养缺陷型合成莽草酸盐的大肠杆菌工程菌株。在此基础上，近年来通过拨 动开关与 QS 系统相结合， 构建了诸多新的基因线路来实现细菌群体的种内通讯以实现特定的目的。 Swofford 等 [70] 构建了 lux QS 系统和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)报告基因耦合开 关，并将其整合到非致病性沙门氏菌中，通过对小鼠体内的定位发现新构建的开关能作为一种生物 标记(biomarker)对肿瘤进行靶向治疗。Soma 等 [71] 在大肠杆菌中构建了一个捆绑 lux 系统和代谢拨动 开关(metabolic toggle switch)调节器，利用该调节器可实现代谢流从三羧酸循环到异丙醇生产的重 新定向，大幅提高了异丙醇的产量。此外，Gupta 等 [72] 设计了依托 QS 机制的 pfk-1 基因(参与糖酵 解) ，可根据发酵时间和细胞密度来确定基因开启的最佳点。当 AHL 不存在时以合成葡萄糖为主， 当 AHL 积累到一定阈值后会关闭 pfk-1 基因的表达，启动肌醇(myoinositol，MI)的产生。 近年来，随着研究的深入，拨动开关的应用已从单一代谢路径进入到了多重动态途径。其中， Doong 等 [73] 的研究最具代表性。他们构建了涉及两个动态调控的机制，这种机制可实现分层调控， 独立调节两种不同酶的表达，从而提高D-葡萄糖醛酸的产量。在这种开关的调解下，可实现细胞"生 长模式"与"生产模式"的切换；相应的，其下游产物(MI和D-葡萄糖醛酸)也可以得到相应控制。 此外，多重调控开关也在Cui 等 [74] 的研究中得到了进一步展示。他们构建了基于两个天然启动子即 PabrB 和PspoiiA 的双功能模块化系统。通过改变启动子结合位点、数目和序列，构建了一个具有 上调和下调能力的启动子库。然后，将双功能模块化系统运用到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中 进行甲萘醌-7(menaquinone-7)的生产，通过该动态途径调控后甲萘醌-7的产量提高了近40倍。此 外，有研究表明，相比传统的luxI-luxR系统而言，加工的esaI-esaR系统能够针对不同启动子同时起到 激活或抑制作用， 更好地实现代谢的重分流效果 [75,76] 。 以上研究均将QS系统与代谢拨动开关相结合， 在达到细胞密度阈值后激活合成线路，从而实现种内细胞自诱导代谢状态的转变。 3.2 生物传感器 与拨动开关类似，生物传感器是另一种作为调节的元件应用于合成生物学研究QS系统的方式 [77] 。 最早的生物传感器是核糖开关，一种适体结构域和表达结构域的组合，可以通过感应底物浓度来实 现对基因表达的动态调节 [78] 。Pang 等 [79] 开发了一种N-乙酰神经氨酸(NeuAc)核糖开关，利用该调 节器可对一些途径和关键酶进行优化，例如提高NeuAc 的产量。随后，Raut 等 [80] 优化了基于哈维 氏弧菌(V. harveyi)BB170 菌株的AI-2型全细胞传感系统。当AI-2进入细胞后会与LuxP结合，进而 启动LuxCDABE的转录，促进荧光素酶及其底物的表达，最终导致生物发光。目前该系统可为炎症 性肠病早期的诊断提供便捷方法。Wen 等 [81] 构建了一种在无细胞蛋白表达系统中的模块化DNA 编 码传感器，可以在纳摩尔水平上定量检测痰样品中的QS信号分子3-oxo-C12-HSL，提高囊性纤维化 疾病的诊断速度。 此外， 光生物传感器与基于蛋白酶的动态双调控开关应用于大肠杆菌工业化生产， 其中光生物传感器将核酸介导的信号放大，得到基因表达量所对应的大肠杆菌密度范围，加上位点 特异性DNA重组酶和细胞裂解酶建立起的两个独立系统，对信号结果做出反馈。这...…”