Inactivation of Competitive Decay Channels Leads to Enhanced Coumarin Photochemistry

Klimek, Robin; Asido, Marvin; Hermanns, Volker; Junek, Stephan; Wachtveitl, Josef; Heckel, Alexander

doi:10.1002/chem.202200647

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“…The results in this chapter were previously published in reference [IV] "Inactivation of competitive decay channels leads to enhanced coumarin photochemistry". 270 The spectroscopic data described in this chapter was measured and analyzed by Marvin In Chapter 4.2, a coumarin PPG was used to induce a strand break in an oligonucleotide. Coumarin was selected instead of o-nitrobenzyl in order to use visible light und reduce cell damage.…”

Section: Systematic Improvement Of Coumarin Ppgsmentioning

confidence: 99%

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New chemical tools to study RNA distribution in neuronal cells

Klimek¹

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The most versatile tool for visualizing endogenous RNA is molecular beacons (MBs). MBs are modified oligonucleotides that consist of a stem-loop structure equipped with a fluorophore and a quencher at the opposite ends. They only give a fluorescent signal when hybridized to the target RNA. Here we present our recent efforts to enhance the spatiotemporal resolution of RNA visualization by refining MBs. We first asked if we could refine MBs to visualize defined subcellular populations of RNA in living neurons. To achieve this, we utilize visible light-activatable Q-dye MBs to allow only a subcellular fraction to be activated. Here, the fluorophore at the 5’-end was linked to a second quencher via a photolabile coumarin protecting group. Therefore, the MB only gives a fluorescent signal, when activated with visible light and hybridized to the target. This architecture allowed local activation of a hybridized subpopulation in a defined area of the cell. Knowing the exact origin of the activated RNA, we were able to increase the available monitoring time for neuronal mRNA from several minutes (literature known MBs) to more than 14 hours. We next asked if it would be possible to gain spatiotemporal control over where the MB hybridization events occur. Therefore, we developed photo-tethered MBs where two phosphates in the loop backbone are covalently linked to each other via two photocages. This prevents the MB from hybridization to the target RNA. Only when light is applied, the photo-tethers are cleaved, and the inherent hybridization function of the MB is activated. This architecture allowed us to control the hybridization of photo-tethered MBs in primary cultured neurons.

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Section: Systematic Improvement Of Coumarin Ppgsmentioning

confidence: 99%

“…Remaining curves can be found in the supporting information of reference [IV]. 270 It was demonstrated that after ca. 200 photon equivalents, about 90% of the starting material 9b released the neurotransmitter serotonin.…”

Section: Systematic Improvement Of Coumarin Ppgsmentioning

confidence: 99%

New chemical tools to study RNA distribution in neuronal cells

Klimek¹

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“…the competing relaxation pathways [159] from the excited state, the solvent interactions and the leaving group (LG) itself. [148] These factors are often not independent from each other, which makes a rational design rather complicated.…”

Section: Photolabile Protecting Groupsmentioning

confidence: 99%

“…The effects of a large variety of site-specific modifications on such coumarin compounds are well studied and have been reported in numerable original publications and reviews. [148,159,[170][171][172] Considering the potential use in biological systems, (7-diethylaminocoumarin-4-yl)methyl (DEACM) and its variants have become model compounds of choice. Besides the relatively large red-shift towards 370-410 nm -depending on the substituents -DEACMbased PPGs also have an increased uncaging quantum yield (QY).…”

Section: Photolabile Protecting Groupsmentioning

confidence: 99%

“…solvent, this ICT state is either stabilized or deactivated via non-radiative or radiative processes. [159,173,174] In the ICT state, the bond between the benzylic carbon and the LG can be heterolytically cleaved which results in the aforementioned TIP. This TIP needs to be sufficiently stabilized by the solvent in order to prevent a recombination process which would yield the initial educt.…”

Section: Photolabile Protecting Groupsmentioning

confidence: 99%

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Multiphoton processes and photocontrol of biochemical reaction pathways

Asido¹

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Die vorliegende Arbeit mit dem Titel Multiphoton Processes and Photocontrol of Biochemical Reaction Pathways befasst sich mit verschiedenen Strategien zur Implementierung von optischer Kontrolle in biochemisch relevanten Systemen. Auf systemischer Ebene wurde einerseits die Licht-getriebene Natriumpumpe Krokinobacter Eikastus Rhodopsin 2 (KR2) vor dem Hintergrund optogenetischer Anwendungen untersucht, und andererseits die Optimierung der wichtigsten photochemischen Parameter von photolabilen Schutzgruppen (PPG, engl. photolabile protecting group) angestrebt. Von der technisch-photophysikalischen Seite wurde ein weiterer Fokus auf den Aktivierungs- und Deaktivierungsschritt gelegt. Hierbei wurden vor allem Mehrphotonen-Prozesse betrachtet, die entweder durch simultane Absorption zweier Photonen zu einer spezifischen hoch-energetischen Anregung führen, oder durch sequentielle Absorption eine sukzessive Aktivierung und Deaktivierung eines Systems bewerkstelligen können. Auch wenn der Schwerpunkt dieser schriftlichen Arbeit auf den spektroskopischen Ergebnissen liegt, waren alle hier diskutierten Projekte stark kollaborativ und umfassten eine große Bandbreite verschiedener Techniken. Dies spiegelt den interdisziplinären Charakter vieler aktueller Fragestellungen in der photochemischen Forschung wider, die - in vielen Fällen - letztlich auf medizinische oder pharmazeutische Fortschritte abzielen. Zunächst wurde die lichtgetriebene Natriumpumpe KR2 untersucht, die durch ihre mögliche Anwendung als optogenetisches Werkzeug bekannt wurde. In einer vergleichenden Studie der Natrium- und Protonenpumpmodi von KR2 konnten wichtige mechanistische Prinzipien für die Funktionalität des Proteins identifiziert werden. Dazu gehört die direkte Beteiligung spezifischer Strukturmerkmale wie die Aminosäure N112 und/oder der ECL1-Domäne am Ionen-Translokationsweg, sowie das enge Zusammenspiel zwischen dem Retinal und seinem Gegenion D116. Gleichzeitig bot diese IR-Studie einen der ersten mechanistischen Einblicke in den Protonenpump-Photozyklus in KR2, der deutlich weniger erforscht war. In Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis Glaubitz wurden die strukturellen Veränderungen des Chromophors und seiner Umgebung während der verschiedenen Photointermediate mittels DNP-verstärkter Festkörper-NMR und optischer Spektroskopie näher untersucht. Hier trugen zeitaufgelöste IR-Messungen in der HOOP (engl. hydrogen out of plane)-Moden-Region dazu bei, die dynamischen Veränderungen der Chromophorkonfiguration und -Verdrillung zu verfolgen. Es konnte gezeigt werden, dass Retinal im O-Intermediat tatsächlich zu seiner all-trans-Konfiguration reisomerisiert wird, aber im Vergleich zu seiner Dunkelzustandskonfiguration deutlich stärker verdreht vorliegt. Dies wurde auch durch die Ergebnisse im nahen UV-Bereich bestätigt, welcher bei der Charakterisierung von mikrobiellen Rhodopsinen oft ausgelassen wird. Die neu gefundene Signatur erwies sich als SBS (engl. second bright state) der 13-cis-Konfiguration des Retinals, die mit der Bildung des O-Intermediats in KR2 verschwindet. Neben der offensichtlichen Verwendung als spektraler Marker wurde der SBS-Übergang auch bezüglich seiner Anwendbarkeit für optische Kontrollexperimente untersucht. Ähnlich wie beim BLQ (engl. blue light quenching)-Effekt war es möglich, den KR2-Dunkelzustand durch Anwendung von fs-Pulsen im nahen UV - ausgehend von einem photostationären Zustand - zu regenerieren. Durch Variation der Probenbedingungen war es möglich, gezielt K (pH~5) oder M (pH~9) anzusteuern, was sich auch in unterschiedlichen Deaktivierungs-Dynamiken äußerte. Diese Ergebnisse können zusammen mit dem hier vorgeschlagenen experimentellen Konzept als Grundlage für komplexere Multiphotonen-Sequenzen im Zusammenhang optogenetischer Fragestellungen verwendet werden.

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Licht‐aktivierte Translation verschiedener mRNAs in Zellen durch wellenlängenabhängiges Photoentschützen

et al. 2022

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Die 5'-Kappe ist ein Kennzeichen der eukaryotischen mRNA und an der Initiation der Translation beteiligt. Ihre Modifikation mit einer einzigen durch Licht abspaltbaren Gruppe kann die Translation von mRNA unter die Kontrolle von Licht bringen. UV-Bestrahlung verursacht jedoch Zellstress und eine Herunterregulierung der Translation. Darüber hinaus beinhalten komplexe Prozesse oft die zeitlich abgestimmte Expression von mehr als einem Gen. Der Ansatz würde daher stark von der Möglichkeit profitieren, eine Entschützung durch sichtbares Licht zu bewirken und mehr als eine mRNA gleichzeitig zu kontrollieren. Wir berichten über die Synthese einer 5'-Kappe, die mit einem 7-(Diethylamino)-Cumarin (CouCap) modifiziert wurde, und über angepasste Bedingungen für die in vitro Transkription. Die Translation der resultierenden Cou-Cap-mRNA ist in vitro und in Säugetierzellen stummgeschaltet und kann durch Bestrahlung mit 450 nm initiiert werden. Die native Kappe wird dabei wiederhergestellt, und an der mRNA verbleiben weder nicht-natürliche Reste noch Sequenzveränderungen. Simultane Kontrolle von zwei verschiedenen mRNAs wurde durch die Kombination von Kappenanaloga mit Cumarin-und ortho-Nitrobenzyl-basierten photospaltbaren Gruppen erreicht.

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Inactivation of Competitive Decay Channels Leads to Enhanced Coumarin Photochemistry

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Multiphoton processes and photocontrol of biochemical reaction pathways

Licht‐aktivierte Translation verschiedener mRNAs in Zellen durch wellenlängenabhängiges Photoentschützen

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