Influence of Parthenogenetic Activation on Nuclear Maturation of Canine Oocytes

Abstract

This study was designed to evaluate the nuclear maturation and maturation promoting factor (MPF) level at different maturation times, and the effect of parthenogenetic activation on nuclear maturation in canine oocytes. Cumulus-oocyte complexes (COCs) were matured in TCM-199 supplemented with 10% fetal bovine serum, hormones, 0.57 mM cysteine, and 10 ng/ml epidermal growth factor for 72 hr at 38.5 degrees C. In Experiment 1, COCs at 0, 24, 48 and 72 hr of culture were assessed for nuclear maturation and MPF levels using histone H1 kinase activity assay. A significantly higher rate of oocytes at 72 hr than 0, 24 and 48 hr of culture developed to metaphase I-anaphase I and metaphase II. Relative abundance of histone H1 kinase activity of oocytes matured for 48 hr increased to ~1.5 x, with a marked increase to approximately 2.5 x for 72 hr, significantly higher than others. In Experiment 2, oocytes matured for 48 hr were parthenogenetically activated with 5 microm ionomycin for 5 min (Group 1) and followed by 10 microg/ml cycloheximide for 3 hr (Group 2), or no treatment (Control). Oocytes were then cultured for 24 hr and assessed for nuclear maturation. A significantly higher rate of oocytes in Group 1 developed to metaphase II than in Group 2 and the control. These results indicated that ionomycin treatment at 48 hr of in vitro maturation had a positive influence on oocyte progression to the metaphase II stage.

Effects of oxygen concentration on in vitro maturation of canine oocytes in a chemically defined serum-free medium

“…Denuding canine oocytes due to their highly inter-digitated cumulus, ZP attachment (Blackmore et al 2004, De los Reyes et al 2009) after culture, is challenging (Hewitt et al 1998). In addition, the lipid droplets inside the oocyte make it very difficult to visualize the chromatin content by simple aceto-orcein staining unless oocytes are fixed for 5-7 days (Song et al 2010). After trying several denuding buffers with different timetables of incubation and vortexing (Reynaud et al 2004), incubation in sodium tri-citrate 1% (Hewitt & England 1999) and denuding using an oocyte holding needle with gauge of 135 m (Yellow EZ-Strip Research Instruments Limited, Cornwall, UK) resulted in complete removal of the cumulus cells.…”

Partenogenetik Aktivasyonun Vitrifiye Köpek Oositleri Üzerine Etkisi

“…Takiben 30 mg/ ml BSA (bovine serum albumin) içeren TL-HEPES içinde 5 dakika bekletildi. 5 Ionomisinle muamele edilen oositler 10 µg/ml siklohekzimide (CHX) içinde 3 saat bekletildi. Hemen ardından, 3.3 mg/mL BSA (FAF-fatty acid free), 11.1 µL/mL sodyum piruvat ve 0.5 µL/mL gentamisinle zenginleştirilen TCM-199 içine alınarak, 39°C ve 5% CO2'lik etüvde 72 saatlik inkübasyona bırakıldı.…”

“…Ionomisinin tek kullanımının, kombinasyondan daha başarılı sonuç verdiği ve GVBD, MI, MII aşamalarındaki oositlerin istatistiksel olarak anlamlı olduğu belirtilmiştir. 5 (Song ve ark., 2010). Ionomisin uygulanan toplam 121 oositten 27'si GVBD, 41'i MI ve 24 tanesi MII aşamasında belirlenmiştir.…”

“…Bu durumun, diğer türlerden farklı olarak, köpeklerin reproduktif karakteristikleri ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. 5,6 Köpeklerde morfolojik olarak germinal vezikül (GV) olarak tanımlanan immatur oositler ovule olur ve maturasyon ekstraovaryan dokuda, post-ovulasyon 48-60 saat arasında tamamlanır. [7][8][9][10] Köpek oositlerinin maturasyon oranları tatmin edici düzeyde olmasa da, bu türler için gen bankası oluşturulması ve nesli tükenen türlerin korunabilmesi için gamet kriyoprezervasyonu önem taşımaktadır.…”

“…18,19 Partenogenetik aktivasyon ve mayotik başlangıç laboratuvar ortamında Ca-EDTA, ionomisin, siklohekzimid ve elektrik stimülasyonu ile köpek oositlerinde test edilmiştir. 5,19,20 Fakat in vitro maturasyon sonrasında vitrifikasyonla dondurulan köpek oositlerinin, partenogenetik aktivasyon testleri yapılmamıştır. Bu nedenle sunulan çalışmada, in vitro maturasyon sonrasında vitrifiye edilen köpek oositlerinin, kalsiyum ionofor ve siklohekzimid ile partenogenetik aktivasyonu sonrasında mayotik başlangıca etkisinin belirlenmesi amaçlanmıştır.…”