O uso abusivo e inadequado de antibióticos é uma prática comum na pecuária leiteira do Brasil, usualmente associados a diagnóstico incorreto de doenças infectocontagiosas, sub dosagens e tratamentos incompletos. Apesar de não ser claro o impacto causado devido ao uso de antibióticos, a cadeia produtiva leiteira é uma importante fonte de desenvolvimento e distribuição de microrganismos resistentes a antibióticos, podendo contribuir com as falhas terapêuticas em humanos. Neste sentido, esse estudo teve como objetivo avaliar a potencial associação de características de propriedades rurais leiteiras e a distribuição de resistência a antibióticos, considerando uma abordagem One Health. Vinte (n = 20) propriedades rurais leiteiras foram selecionadas nas regiões de Viçosa, MG (n = 10) e Palotina, PR (n = 10) e seus proprietários entrevistados considerando um questionário epidemiológico contendo questões objetivas relacionadas às características da propriedade rural, produção leiteira, higiene de ordenha e sanidade animal. Amostras de leite, fezes de animais e humanos e água das propriedades rurais selecionadas foram obtidas (n = 340) e submetidas a análises microbiológicas para isolamento de Escherichia coli; Os 1.091 isolados obtidos foram caracterizados quanto aos seus perfis de resistência à amoxicilina (AMO), ceftiofur (CEF), ciprofloxacina (CIP), cloranfenicol (CLO), sulfamentaxazol + trimetropima (SUT) e tetraciclina (TET), pelo teste de diluição em ágar. Considerando o número total de animais, as propriedades rurais foram classificadas em pequenas (n = 13), semiextensivas (n = 3) e intensivas (n = 4), todas com características heterogêneas na produção leiteira. Nenhuma propriedade rural indicou controle da incidência de mastite e outras doenças infectocontagiosas e tampouco gastos com medicamentos e perda de animais. Amoxicilina e tetraciclina foram os antibióticos com maiores índices de resistência (37,5% e 36,4%, respectivamente), e ao menos uma propriedade de cada grupo apresentou isolados resistentes. Todos os grupos de propriedades rurais apresentaram isolados de E. coli com variados perfis de resistência e com múltipla resistência (MDR). Propriedades rurais de criação intensiva apresentaram o maior percentual de micro-organismos MDR (14,6%) e maior variedade de perfis de MDR. Os perfis de resistência AMO-SUT-TET, AMO-CLO-TET, AMO-CEF-SUT-TET, AMO-CIP-CLO- SUT-TET estiveram presentes em todos os grupos. Considerando os resultados obtidos, é possível concluir que independentemente das características do tamanho e das características das propriedades, as medidas adotadas para evitar o desenvolvimento e distribuição de micro- organismos resistentes não são adotadas de maneira consciente e sistemática. Mais estudos são necessários, para consolidar um monitoramento efetivo de presença e distribuição de micro- organismos resistentes nos diferentes pontos críticos deste sistema de produção. Palavras-chave: Escherichia coli genérica. Sistema de produção. Enfermidades.