Las enfermedades causadas por hongos en las plantas son una gran preocupación en la producción agrícola. Los macromicetos son una fuente potencial de compuestos antifúngicos que podrían usarse para controlar estas enfermedades. El objetivo de este estudio fue evaluar la actividad biocontroladora in vitro de cuatro macromicetos de los géneros Xylaria, Agrocybe, Psilocybe y Stereum sobre diferentes hongos fitopatógenos. Para ello, se determinó la curva de crecimiento de los macrohongos en dos medios: papa dextrosa (PDA) y salvado de trigo (ST) y se caracterizaron las interacciones y la inhibición in vitro de hongos fitopatógenos. Se realizó la extracción y caracterización de metabolitos secundarios de la biomasa, el medio extracelular y del homogeneizado del micelio y caldo en los hongos con mayor porcentaje de inhibición. Finalmente, se evaluó la actividad antifúngica in vitro de estos extractos. Las curvas de crecimiento cambiaron con la fuente de carbono, tres de cuatro macrohongos mostraron una mayor acumulación de biomasa en PDA que en ST. Las interacciones de Xylaria se clasificaron principalmente como reemplazo, obteniendo el mayor nivel de antagonismo en PDADos de los tres extractos evaluados mostraron actividad antifúngica contra los tres patógenos aislados en concentraciones de 18 μg/ml para extractos metanólicos de biomasa y 2,5 % para el filtrado de homogeneizado con inhibiciones de 10 % a 80 %. La caracterización de los metabolitos de Xylaria mostró como posibles compuestos responsables de la actividad a los ácidos grasos. Este trabajo mostró el potencial de estos hongos para el control de enfermedades fúngicas.