Isolation and characterization of a novel metalloprotease inhibitor from Bothrops alternatus snake serum

Abstract

Resistance of snakes and some other animals to snake envenomation has been attributed to soluble factors present in their tissues. Here we report the isolation of a novel metalloprotease inhibitor from Bothrops alternatus snake serum (named BaltMPI) with high purity, using a four-step chromatographic method. BaltMPI has molecular weights of 60.5 and 42.4kDa, as determined by SDS-PAGE and mass spectrometry, respectively, and pI=5.27. The first 60 amino acids from the N-terminal region of BaltMPI, determined by Edman's degradation, showed high homology (97%) with the snake venom metalloprotease inhibitor (SVMPI) BJ46a and other SVMPIs (78-82%). The chromatographic fractions and purified BaltMPI exhibited anti-hemorrhagic activity against Batroxase and BjussuMP-I. BaltMPI was stable over wide ranges of pH (1, 5, 8, and 9) and temperature (-80, -20, 4, 60, and 100°C), and suppressed the fibrinogenolytic, fibrinolytic, and azocaseinolytic activities of Batroxase. BaltMPI specifically inhibited the activity of metalloproteases, without affecting the activity of serine proteases. Together, our results suggest that BaltMPI and other SVMPIs are promising molecules for the treatment of snake envenomation, in particular that caused by Bothrops sp.

Snakebite Therapeutics Based on Endogenous Inhibitors from Vipers

“…Recently, BaltMPI [58] was found as a hemorrhagic inhibitor in Bothrops alternatus serum. BaltMPI should also be of the fetuin family as the N-terminal region consists of 60 amino acid residues (determined by Edman degradation) that showed high homology (97%) with BJ46a.…”

Structure-Based Discovery of Thiosemicarbazone Metalloproteinase Inhibitors for Hemorrhage Treatment in Snakebites

“…In this study, the authors related this effect probably to the formation of inactive metalloprotease−inhibitor complexes during the incubation period. 27 The treatment The same sequence was used for A and B. The ratios of 1:1, 1:5, and 1:10 Bp/5b (w/w).…”

Purificação e caracterização de inibidores de proteases dos soros de Crotalus durissus terrificus e Didelphis marsupialis

“…Traços horizontais indicam sequências não disponíveis para comparação ou gaps introduzidos numa sequência para maximizar o alinhamento entre as sequências. Os inibidores cujas sequências foram comparadas com a do crotaini são fatores hemorrágicos de soros de Gloydius brevicaudus (cHLP-A; ID: Q5KQS3), de Protobothrops flavoviridis (HSF; ID: P29695), de B. jararaca (Bj46a; ID: Q9DGI0), de Gloydius brevicaudus (cHLP-B; ID: Q5KQS2), e de B. alternatus, o BaltMPI (Palacio et al 2017). jararaca (100 mg) foi dissolvido em 10 mL de TBS e aplicado lentamente na coluna de afinidade Sepharose-SFTI-R. Após lavagem da coluna por passagem de TBS seguida de SSN para retirada de proteínas fracamente ligadas, a resina foi percolada com NaCl 0,5 M. Foram coletadas frações de 1 mL, medindo-se as respectivas A280nm e atividades proteolíticas sobre o BApNA, medidas por A405nm do produto formado nas reações e indicadas no gráfico.…”

“…As proteases dos venenos estão presentes em diferentes proteoformas, ou seja, proteínas com substituição de alguns aminoácidos que não formam parte dos domínios catalíticos, diferentes níveis de glicosilação, ou como é o caso de SVMP, podem incluso ter um arranjo diferente dos domínios que as compõem, o que resulta em variações estruturais nas proteínas maduras (Serrano et al 2014). Isto, quando as enzimas sofrem autólises, pode resultar na origem de fragmentos de tamanho molecular entre 30 e 40 kDa, que no caso da bothropasina corresponderiam ao domínio DC formado pelo domínio tipo desintegrina e o domínio intacto rico em cisteínas (Assakura et al 2003), e no caso da jararhagina, esses fragmentos produzidos pela autólise da enzima, corresponderiam à perda do domínio jararhagin-C (Moura-da-Silva e Paine 2013 Esta massa molecular do crotaini se encontra dentro da faixa usual para estes inibidores, assemelhando se às massas moleculares de outros inibidores de metaloproteases isolados a partir do soro ou plasma de serpentes: 46 kDa do BJ46a (Valente et al 2001), 66 kDa do BaSAH (Borkow et al 1995), 61 kDa do BaltMPI (Palacio et al 2017), 48 kDa do HSF (Omori-Satoh et al 1972), e 47 kDa do TMI (Huang et al 1999).…”

“…A massa molecular do crotaini também foi determinada mediante espectrometria (Aoki et al 2009); o fator HSF é um fator anti-hemorrágico isolado a partir do soro da serpente Protobothrops flavoviridis por (Omori-Satoh et al 1972); o fator BJ46a é um fator anti-hemorrágico isolado a partir do soro da serpente Bothrops jararaca por (Valente et al 2001); e o fator BaltMPI é um fator anti-hemorrágico isolado a partir do soro da serpente Bothrops alternatus por (Palacio et al 2017). (Neves-Ferreira et al 2002, Brand et al 2012, enquanto que para os inibidores isolados a partir do soro de serpentes, tem sido reportada uma estequiometria de 2 metaloproteases para 1 BJ46a (Valente et al 2001), e de 1 para 1 no caso do HSF (Deshimaru et al 2005).…”