In den letzten Jahren hat die Forschung an und mit Stammzellen großes Interesse auf sich gezogen, da diese Zellen das Potenzial haben, defekte oder abgestorbene Zellen im Organismus zu ersetzen. Je nach Typ und Umgebung, in die sie eingebracht werden, können sich Stammzellen in ganz unterschiedliche Zelltypen entwickeln.Interessant ist insbesondere die Anwendung von Stammzellen im Innenohr [5,17,21]. Die Haarzellen stellen die empfindlichsten Elemente im Innenohr dar, und ihre Schädigung bzw. ihr Tod ist der häufigste Grund für eine Schallempfindungsschwerhörigkeit. Da Haarzellen bei Säugetieren, anders als bei manchen Vö-geln und Amphibien, nicht regenerieren, führt ihr Tod zu einem irreversiblen Gehörsverlust. Patienten mit einem Hörver-lust aufgrund unterschiedlichster Ursachen [11] verlieren an Lebensqualität [12]. Umso wichtiger ist es daher, das geschä-digte Ohr z. B. durch Hörhilfen zu verbessern [1,2,13]
Infektion der Vorläuferzellen mit einem GFP-exprimierenden AdenovirusDie Vorläuferzellen wurden mit einem Adenovirus infiziert, der GFP exprimiert (500 Viruspartikel pro Zelle); 16 Stunden nach Infektion wurden die Zellen gewaschen, in PBS Lösung aufgenommen und transplantiert.
Charakterisierung der neurogenen VorläuferzellenDie GFP + -neuralen Vorläuferzellen wurden mit 4% Paraformaldehyd in PBS fixiert und mit 5% Triton X-100 in PBS zusammen mit 10% FBS permeabilisiert. Folgende Antikörper wurden verwendet, um die Vorläuferzellen zu charakterisieren: Nestin (Maus, monoklonal, #556309, BD Biosciences, Schweiz) 1:200 2 h bei Raumtemperatur, Sox-2 (Kaninchen, monoklonal, S7693, Sigma Aldrich Chemie, Schweiz) 1:200 2 h bei Raumtemperatur, Myosin VIIa (Ziege, polyklonal, A-16, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) 1:100 2 h bei Raumtemperatur, Tuj1 (Maus, monoklonal, C4585, Sigma-Aldrich Chemie, Schweiz) 1:100 2 h bei Raumtemperatur, Math1 (Kaninchen, polyclonal, Abcam, Cambridge, England) 1:100 2 h bei Raumtemperatur, Texas Red X-phalloidin (Molecular Probes, Eugene, USA) 1:300 für 1 h bei Raumtemperatur. Die entsprechenden sekundären fluoreszierenden Antikörper wurden für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA; 1:300). Die Zellkerne wurden mit DAPI gefärbt (1 min). Die Zellen wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (Olympus, Schweiz) visualisiert und photographiert (AxioCam Carl Zeiss, Schweiz; . Abb. 2).
Transplantation von Vorläuferzellen auf Innenorexplantate in vitroIn Zellkulturplatten, die jeweils 3 CortiOrgane enthielten, wurden 2×104 GFP + -neurogene Vorläuferzellen transferiert. Die infizierten Explantate wurde daraufhin in serumfreiem Medium mit N2 Supplement, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml bFGF und 50 ng/ml IGF-1 für 7 Tage kultiviert.
ImmunhistochemieNach der Kultivierung wurden die Innenohrexplantate zusammen mit den adhärenten GFP + -Vorläuferzellen in 4% Paraformaldehyd fixiert und mittels 5% Triton X-100 in PBS zusammen mit 10% FBS permeabilisiert. Anschließend erfolgte die Inkubation der Corti-Explantate mit Texas Red X-phalloidin (1:300; Molecular Probes,...