Hay pocos estudios ecológicos sobre los patrones de diversidad de los macroinvertebrados acuáticos en la Amazonía peruana, a pesar de ser esenciales para la gestión y manejo de estos ecosistemas fluviales. En este contexto, el objetivo del presente estudio fue determinar su composición taxonómica y su relación con las variables ambientales a lo largo de un gradiente altitudinal del río Alto Madre de Dios, cuenca en donde podrían registrarse nuevas especies. Se establecieron 22 estaciones en un rango altitudinal de 398 a 2.411 m s.n.m., cuantificando las características fisicoquímicas del agua y del hábitat fluvial: pH, temperatura del agua (T, °C), conductividad eléctrica (CE, μS.cm-1), ancho del río (A, m), profundidad (P, cm), sombra y velocidad del flujo de la corriente (m·s-1). Para los muestreos de macroinvertebrados se utilizó una red “de patada” de 200 μm de tamaño de malla. Se identificaron 56 taxones distribuidos en los órdenes Acari, Ephemeroptera, Coleoptera, Diptera, Hemiptera, Megaloptera, Odonata, Plecoptera, Trichoptera y Decapoda. Los análisis multivariados de clasificación y agrupamiento permitieron establecer cuatro grupos de estaciones estadísticamente diferenciadas (p<0,05), principalmente por la velocidad y el tipo de sustrato dominante, lo que explica la abundancia y amplia distribución de Chironomidae, Baetodes, Thraulodes y Anacroneuria. Los taxones de macroinvertebrados cambiaron notablemente a lo largo del gradiente, reportándose una mayor diversidad en zonas con altitudes medias y una relación con las variables ambientales.