Local Stoichiometries Determined by Counting Individual Molecules

Abstract

The capability of optical single-molecule microscopy for quantitative determination of local stoichiometries is demonstrated. Biotin-streptavidin embedded in a phospholipid membrane was chosen as a model system. At a local resolution of 30 nm and a time resolution of 35 ms, it was possible to determine local stoichiometries between one and four occurring in this system. The "stoichiometric resolution" of the method is analyzed by statistical means. From this a quantitative criterion is derived for the reliability in assigning a defined number of fluorophores to each individual fluorescence peak observed. It is shown that only a few (n ≈ 10) observations are sufficient for reliable assignments.

Scanning near-field optical microscopy with aperture probes: Fundamentals and applications

“…[95][96][97] We investigated microcontact-printed patches of protein molecules, specifically chicken immunoglobulin labeled with tetramethyl-rhodamine-isothiocyanate ͑TRITC͒, 95 using SNOM. The patches consist of a monolayer of close-packed protein molecules, Ϸ4ϫ10ϫ14 nm 3 in size.…”

Membrane heterogeneity – from lipid domains to curvature effects

“…Single-molecule experiments, on the other hand, mostly depend on universal properties of fluorescent tags and inherently possess the aspired sensitivity. It was shown in vitro that the number of molecules can be determined from the intensity of attached fluorophores (121). Both, the use of fluorescent proteins, which exhibit complex photophysics (109), and the presence of high noise make this type of analysis more challenging in the in vivo context.…”

Mouvements cellulaires et moléculaires

“…Ils permettent néanmoins de décrire, en première approximation, une proportion conséquente des mouvements observables à ces échelles. Des fluctuations temporelles, telles que vitesse réduite ou colocalisation [41] (Figure 5B), peuvent permettre d'identifier des phénomènes transitoires, tels qu'une stimulation [21,22,[32][33][34]. L'un des attraits majeurs d'une étude à l'échelle de cellules ou de molécules individuelles est de recueillir des données détaillées pour chaque trajectoire, voire pour chaque pas temporel, et donc de pouvoir établir la distribution d'un paramètre ( Figure 5C) lorsque d'autres mesures ne donneraient qu'une valeur moyenne.…”

“…L'un des attraits majeurs d'une étude à l'échelle de cellules ou de molécules individuelles est de recueillir des données détaillées pour chaque trajectoire, voire pour chaque pas temporel, et donc de pouvoir établir la distribution d'un paramètre ( Figure 5C) lorsque d'autres mesures ne donneraient qu'une valeur moyenne. Ceci permet d'établir, par exemple, si le paramètre suit une distribution gaussienne ou présente plusieurs composantes pouvant être reliées à différents états, tels que la vitesse réduite pour des cellules en interaction transitoire, ou l'intensité de fluorescence doublée pour des molécules dimérisées [41]. Le mouvement cellulaire implique l'activation et la coordination du cytosquelette et des complexes d'adhérence.…”