<title>Flow cytofluorometric assay of human whole blood leukocyte DNA degradation in response to <emph type="1">Yersinia pestis</emph> and <emph type="1">Staphylococcus</emph> aureus</title>

Abstract

Human leukocytes containing less than 2C DNA per cell (damaged or dead cells) were detected and quantified by flow cytometry and DNA-specific staining with ethidium bromide and mithramycin in whole blood infected with Staphylococcus aureus or Yersinia pestis. Addition of live S. aureus to the blood (100 microbe cells per one leukocyte) resulted in rapid degradation of leukocyte DNA within 3 to 6 hours of incubation at 37 °C. However, only about 50 percent cells were damaged and the leukocytes with the intact genetic apparatus could be found in the blood for a period up to 24 hours. The leukocyte injury was preceded by an increase of DNA per cell content (as compared to the normal one) that was likely to be connected with the active phagocytosis of S.aureus by granulocytes (2C DNA of diploid phagocytes plus the all bacterial DNA absorbed). In response to the same dose of actively growing (at 37 °C) virulent Y.pestis cells, no increase in DNA content per cell could be observed in the human blood leukocytes. The process of the leukocyte DNA degradation started after a 6-hours' incubation, and between 18 to 24 hours of incubation about 90 percent leukocytes (phagocytes and lymphocytes) lost their specific DNA fluorescence.These results demonstrated a high potential of flow cytometry in comparative analysis in vitro of the leukocyte DNA degradation process in human blood in response to bacteria with various pathogenic properties. They agree with the modern idea of an apoptotic mechanism of immunosuppression in plague.

Flow-Cytofluorimetric Analysis of Cytotoxicity of Yersinia Pestis Strains

“…Перед исследованием лейкоциты осаждали центрифугированием (400 g, 10 мин) и окрашивали в течение 15 мин смесью бромида этидия и митрамицина: 0,1 мольТрис-HCl буфера (pH 7,6) с добавлением 0,15 М NaCl, 0,04 М Mg CI2, 25 мкг/мл бромида этидия (Serva, Германия) и 50 мкг/мл митрамицина (Sigma, США) из расчета 1 мл раствора красителя на 105 -106 лейкоцитов. ДНК-гистограммы лейкоцитов регистрировали с помощью проточного цитофлуориметра ICP-22 фирмы PHYWE (Германия) и под считывали гиподиплоидные лейкоциты (в апоптозе), несущие менее 2С Д Н К на клетку и обладающ ие пониж енной интенсивностью Д Н Кфлуоресценции [11].…”

“…Имеются еди ничны е работы , посвященные изу чению динамики гибели лейкоци тов в о б р азц ах цельной крови че ловека, обсем е ненных живыми Y. pestis [7,11]. Анализ ДНК-гистограмм начинали с оценки контрольных образцов.…”

“…В отрицательном контроле через 24 ч инкубации при 37°С лейкоциты фактиче ски не подвергались апоптозу. В положительном контроле был зарегистриро ван интенсивный цитотоксический эффект, что подтвердило полученные ранее данные [7,11].…”