Mapping of the Tobacco Mosaic Virus Movement Protein and Coat Protein Subgenomic RNA Promoters in Vivo

Abstract

The Tobacco mosaic virus movement protein (MP) and coat protein (CP) are expressed from 3'-coterminal subgenomic RNAs (sgRNAs). The transcription start site of the MP sgRNA, previously mapped to positions 4838 (Y. Watanabe, T. Meshi, and Y. Okada (1984), FEBS Lett. 173, 247-250) and 4828 (K. Lehto, G. L. Grantham, and W. O. Dawson (1990), Virology 174, 145-157) for the TMV OM and U1 strains, respectively, has been reexamined and mapped to position 4838 for strain U1. Sequences of the MP and CP sgRNA promoters were delineated by deletion analysis. The boundaries for minimal and full MP sgRNA promoter activity were localized between -35 and +10 and -95 and +40, respectively, relative to the transcription start site. The minimal CP sgRNA promoter was mapped between -69 and +12, whereas the boundaries of the fully active promoter were between -157 and +54. Computer analysis predicted two stem-loop structures (SL1 and SL2) upstream of the MP sgRNA transcription start site. Deletion analysis and site-directed mutagenesis suggested that SL1 secondary structure, but not its sequence, was required for MP sgRNA promoter activity, whereas a 39-nt deletion removing most of the SL2 region increased MP sgRNA accumulation fourfold. Computer-predicted folding of the fully active CP sgRNA promoter revealed one long stem-loop structure. Deletion analysis suggested that the upper part of this stem-loop, located upstream of the transcription start site, was essential for transcription and that the lower part of the stem had an enhancing role.

RNA Helicase Domain of Tobamovirus Replicase Executes Cell-to-Cell Movement Possibly through Collaboration with Its Nonconserved Region

“…The genomic RNA of TMV is 6,395 nucleotides (nt) long (6) and encodes at least four proteins. The full-length RNA is used to produce 126-kDa and 183-kDa replicase proteins (14), while the 30-kDa movement protein (MP) and the 17.5-kDa coat protein are translated from 3Ј-coterminal subgenomic mRNAs (9,13,25). These coding regions are flanked by the 5Ј and 3Ј untranslated regions, both of which are required for viral replication (20,21).…”

El virus del manchado foliar de los cítricos: caracterización del promotor del RNA subgenómico del gen de la proteína de la cápsida y del supresor del silenciamiento de RNA

“…La inoculación de protoplastos con transcritos de RNA sintetizados in vitro a partir de clones infecciosos de cDNA ha sido una herramienta muy valiosa para estudiar in vivo las secuencias asociadas con la promoción y síntesis de los sgRNAs de muchos virus de plantas (Grdzelishvili et al, 2000;Ayllón et al, 2003Ayllón et al, ,2004Li y Wong, 2006;. Sin embargo, en protoplatos de N. occidentalis, N. benthamiana y cidro Etrog inoculados con transcritos infecciosos de CLBV, sólo se detectaron pequeñas cantidades de RNA viral (gRNA y sgRNAs), por lo que fue imposible realizar estos estudios utilizando este sistema genético.…”

“…La mutación del nucleótido G (+1), identificado previamente como el inicio de transcripción del CP-sgRNA , por A, C o T disminuyó notablemente la síntesis de este sgRNA, sugiriendo que esta G juega un papel importante en el reconocimiento del inicio de transcripción del CP-sgRNA por la polimerasa viral. Estos resultados avalan trabajos anteriores, en los que se sugería que la mutación del primer nucleótido de los sgRNAs podría ser una herramienta útil para confirmar el inicio de transcripción de los mismos detectado por otros métodos (Grdzelishvili et al, 2000;Koev y Miller, 2000). La presencia de una G en el inicio de transcripción de los sgRNAs también se ha observado en otros virus como AMV (van der Kuyl et al, 1990), el virus de la quemadura negra de la remolacha azucarera (Beet black scorch virus, BBSV) (Yuan et al, 2006), BMV (French y Ahlquist, 1998), HCRSV (Li y Wong, 2006), TMV (Grdzelishvili et al, 2000) y TCV (Wang y Simon, 1997;Wang et al, 1999).…”

“…Hasta la fecha se han caracterizado diversos promotores de sgRNAs de varios virus cuyos tamaños oscilan entre 24 (Johnston y Rochon, 1995; Wang y Simon, 1997) y más de 100 nt (Balmori et al, 1993;van der Vossen et al, 1995;Grdzelishvili., et al, 2000;Koev y Miller, 2000). En los virus que utilizan el mecanismo de iniciación interna para la síntesis de los sgRNAs, como norma general, la mayor parte de la secuencia promotora se localiza inmediatamente antes del inicio de transcripción del sgRNA (French y Ahlquist, 1988;Levis et al, 1990;Boccard y Baulcombe, 1993;Johnston y Rochon 1995;van der Vossen et al, 1995;Wang y Simon, 1997;Koev et al, 1999;Wang et al, 1999;Miller y Koev, 2000).…”

“…Sin embargo, hay algunos virus en los que la secuencia promotora puede estar situada antes del inicio de transcripción pero alejada físicamente del mismo, después del inicio de transcripción o incluso puede estar situada en otra molécula de RNA (Balmori et al, 1993;Sit et al, 1998;Koev y Miller, 2000). Los promotores que son reconocidos por la RdRp para iniciar la síntesis de los sgRNAs pueden ser tanto estructuras primarias Johnson et al, 2003) como secundarias (Grdzelishvili et al, 2000;Li y Wong, 2006) y se localizan en la cadena negativa del gRNA del virus. Hay virus que presentan diferentes promotores para los diferentes sgRNAs, lo que permite regular la transcripción de los distintos genes codificados por el mismo, como ocurre con el virus de la tristeza de cítricos (CTV) (Ayllón et al, 2003).…”