El metapneumovirus humano se ha establecido como uno de los principales virus causantes de morbilidad y mortalidad por infección respiratoria aguda en lactantes. En Colombia, los estudios de vigilancia de virus respiratorios son limitados y se desconoce la frecuencia local de este virus, más aun considerando que algunos anticuerpos utilizados en inmunofluorescencia tienen reacción cruzada con el virus respiratorio sincitial. Para discriminar entre estos dos pneumovirus, se realizó PCR en tiempo real e inmunofluorescencia en 106 aspirados nasofaríngeos de niños sintomáticos menores de dos años. La concordancia entre la prueba molecular y la inmunofluorescencia fue κ=0,82 para metapneumovirus y κ=0,57 para virus respiratorio sincitial. Combinando los resultados de ambos métodos, el metapneumovirus humano fue el segundo virus más frecuente, en el 17% de los casos, y el virus sincitial respiratorio fue el más detectado (59,4%), y la principal causa de bronquiolitis; otros virus presentes fueron parainfluenza-3 (3,8%) e influenza B (1,9%). Este estudio describe la etiología viral en niños con infección respiratoria aguda en Cali; el uso posterior de las estrategias diagnósticas confirmó que el metapneumovirus humano circula todo el año en las unidades pediátricas, lo que expone la creciente necesidad de ampliar la sospecha clínica a virus no clásicos.