As perdas consideráveis no armazenamento de maçãs decorrem principalmente de desordens microbiológicas, causadas por Penicillium expansum, que além de colonizar o fruto e causar dano à polpa, produz a patulina, micotoxina teratogênica e cancerígena. Entre as alternativas ao tradicional tratamento químico de doenças pós-colheita de frutos, enfoca-se o biocontrole por leveduras antagonistas, com ênfase em linhagens killer, em função da baixa possibilidade de resíduos tóxicos e com ampla inocuidade demonstrada nos processos fermentativos. O objetivo deste trabalho foi analisar o potencial antagônico de leveduras no controle de P. expansum, mediante antifungigrama em meio sólido e líquido. Do total de 44 leveduras isoladas (16 de frutas, 10 de silagem de milho e 18 de formigueiro de laboratório), 20 apresentaram antagonismo perante esporos de P. expansum em ágar Meio Para Levedura, sendo Debaryomyces hansenii C1 responsável por maior atividade associada à competição por nutrientes (zona de inibição de 31 mm) e D. hansenii C7 por antibiose/hiperparasitismo (15 mm). Entretanto, o ensaio realizado com o sobrenadante de cultivo reduziu o número de cepas ativas em cinco, sendo Pichia ohmeri 158 e Candida guilliermondii P3 as de maior atividade antagônica. No antifungigrama em meio líquido (caldo MPL) o sobrenadante do cultivo de C. guilliermondii (25ºC/72 horas) inibiu 58,15% da germinação dos esporos de P. expansum e P. ohmeri (25ºC/48 horas) inibiu o desenvolvimento de hifas em 66,17%. A atividade do meio extracelular baseado em antibiose sugeriu mecanismo associado ao caráter killer, uma vez que ambas as leveduras foram positivas perante as linhagens padrão S. cerevisiae NCYC 1006 e P. kluyveri CAY-15. A diferença entre os sobrenadantes obtidos do cultivo destas leveduras isoladamente e em interação com o fungo teste, visando estímulo adicional na produção de substância antifúngica, não foi significativa (P > 0,05). De acordo com os resultados obtidos, conclui-se que a aplicação de leveduras antagonistas constitui ferramenta promissora no controle biológico de P. expansum em pós-colheita de maçã. Palavras-chave: Penicillium expansum, leveduras antagonistas, biocontrole DOI: 10.5433/1679 Abstract Considerable losses during apple fruit storage occur due to microbiological diseases, mainly caused by Penicillium expansum, which in addition to fruit pulp deterioration produces patulin, a mycotoxin with carcinogenic and teratogenic activity. Biological control of post-harvest disease by antagonist yeasts