Modulation of Rab5 and Rab7 Recruitment to Phagosomes by Phosphatidylinositol 3-Kinase

Abstract

Phagosomal biogenesis is central for microbial killing and antigen presentation by leukocytes. However, the molecular mechanisms governing phagosome maturation are poorly understood. We analyzed the role and site of action of phosphatidylinositol 3-kinases (PI3K) and of Rab GTPases in maturation using both professional and engineered phagocytes. Rab5, which is recruited rapidly and transiently to the phagosome, was found to be essential for the recruitment of Rab7 and for progression to phagolysosomes. Similarly, functional PI3K is required for successful maturation. Remarkably, inhibition of PI3K did not preclude Rab5 recruitment to phagosomes but instead enhanced and prolonged it. Moreover, in the presence of PI3K inhibitors Rab5 was found to be active, as deduced from measurements of early endosome antigen 1 binding and by photobleaching recovery determinations. Though their ability to fuse with late endosomes and lysosomes was virtually eliminated by wortmannin, phagosomes nevertheless recruited a sizable amount of Rab7. Moreover, Rab7 recruited to phagosomes in the presence of PI3K antagonists retained the ability to bind its effector, Rab7-interacting lysosomal protein, suggesting that it is functionally active. These findings imply that (i) dissociation of Rab5 from phagosomes requires products of PI3K, (ii) PI3K-dependent effectors of Rab5 are not essential for the recruitment of Rab7 by phagosomes, and (iii) recruitment and activation of Rab7 are insufficient to induce fusion of phagosomes with late endosomes and lysosomes. Accordingly, transfection of constitutively active Rab7 did not bypass the block of phagolysosome formation exerted by wortmannin. We propose that Rab5 activates both PI3K-dependent and PI3K-independent effectors that act in parallel to promote phagosome maturation.

Alteraciones en el reclutamiento y activación de proteínas Rab durante la infección micobacteriana

“…Actualmente, se postula que los componentes tardíos o lisosómicos pueden llegar a los fagosomas, al menos, por dos vías diferentes: una dependiente de PI3K, que participa principalmente en la adquisición de hidrolasas, y la otra, independiente, que participa en la adquisición de proteínas integrales de la membrana, como la bomba de protones ATPasa (26).…”

“…La transfección con una secuencia que codifica un inactivador de Rab5 como la RN-tre (una GAP), disminuye la incorporación de marcadores de endosomas tardíos como LAMP-1 y Rab7 (26). Estos resultados indican que se requiere Rab5 unida a GTP para la formación de endosomas tempranos y la fusión o asociación entre estos endosomas.…”

“…Estos resultados indican que la capacidad de desactivación de Rab5, es decir, la disociación de Rab5 de los fagosomas cuando se hidroliza el GTP, es importante para permitir que los compartimentos maduren y, al parecer, esta disociación está asociada con la actividad de la PI3K (26).…”

“…A pesar de esto, la Rab7 puede ser adquirida por estos compartimentos, posiblemente de la reserva del citosol, de una forma independiente de la PI3K. Deben existir, por lo tanto, dos señales para la fusión con estos endosomas tardíos: una dependiente de las Rab y otra dependiente de la PI3K (26).…”

“…En contraposición con otros resultados (26), se ha observado que el bloqueo de la función de PI3K con Wortmannin y LY94002 previene significativamente la adquisición de EEA-1 en las endomembranas de los LBC; sin embargo, cuando se purifican los fagosomas y se evalúa directamente la expresión de la PI3K tipo III hVPS34, se encuentra que tanto los LBC como los MCP reclutan esta cinasa, aunque los MCP lo hacen más tempranamente. Esto sugiere, finalmente, la necesidad de VPS34 y Rab5 en el reclutamiento de EEA-1.…”