Penelitian dilakukan untuk mengidentifikasi keragaman gen FSH beta-subunit dengan metode PCR-RFLP sebagai penanda kualitas sperma pada sapi Bali. Pengambilan sampel darah untuk ekstraksi DNA dari berbagai populasi sebanyak 470 sampel dan 127 sampel yang berasal dari Balai Nasional Inseminasi Buatan dan Balai Inseminasi Buatan Regional beserta data sperma. Frekuensi alel pada sapi Bali adalah alel A (0,000) dan alel B (1,000). Tidak ditemukannya alel A menunjukkan gen FSH betasubunit pada sapi Bali bersifat monomorfik. Hasil yang berbeda pada sapi Brahman, FH, Simmental dan Limousin yang bersifat polimorfik dengan adanya alel A dan B. Heterozigositas pengamatan tertinggi pada sapi Limousin (0,318) dan heterozigositas harapan tertinggi pada sapi Simmental (0,420). Nilai chi-square tidak berpengaruh nyata pada sapi Bali dan Simmental, namun pada sapi Brahman, FH dan Limousin berpengaruh nyata. Pada bangsa sapi yang dianalisis persentase abnormalitas sperma lebih tinggi ditemukan pada sapi Simmental, Limousin, Brahman dibandingkan pada sapi Bali dan FH. Persentase abnormalitas sperma tipe abaxial lebih tinggi ditemukan pada sapi Brahman, Simmental dibandingkan pada sapi FH. Dari semua tipe abnormalitas sperma, persentase tipe abaxial dan microcephalus paling tinggi.