2015
DOI: 10.1002/jmr.2456
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N-terminal processing of affinity-tagged recombinant proteins purified by IMAC procedures

Abstract: The ability of a new class of metal binding tags to facilitate the purification of recombinant proteins, exemplified by the tagged glutathione S-transferase and human growth hormone, from Escherichia coli fermentation broths and lysates has been further investigated. These histidine-containing tags exhibit high affinity for borderline metal ions chelated to the immobilised ligand, 1,4,7-triazacyclononane (tacn). The use of this tag-tacn immobilised metal ion affinity chromatography (IMAC) system engenders high… Show more

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“…Fusion of peptides with large-sized tags has been found to increase their expression level. GST tag is highly efficient, when positioned in the N-terminal than in the C-terminal of proteins or peptides [19]. Expression of gp46-I(162-214)was induced with IPTG (final concentration 1 mM) at 37°C for 4 hours.…”
Section: Discussionmentioning
confidence: 99%
“…Fusion of peptides with large-sized tags has been found to increase their expression level. GST tag is highly efficient, when positioned in the N-terminal than in the C-terminal of proteins or peptides [19]. Expression of gp46-I(162-214)was induced with IPTG (final concentration 1 mM) at 37°C for 4 hours.…”
Section: Discussionmentioning
confidence: 99%
“…This step was performed twice. The tagged protein was recovered by suspending the resin in 500 mM imidazole, 500 mM sodium chloride, pH 7.4 (1.5:1) at 300 rpm at 4 °C for 20 min [33]. …”
Section: Methodsmentioning
confidence: 99%
“…Geralmente, os agentes quelantes utilizados em IMAC são moléculas pequenas que possuem átomos doadores de elétrons, como o nitrogênio, oxigênio e enxofre (BRESOLIN; MIRANDA;.A classificação dos agentes quelantes é definida de acordo com o número de sítios de ligação do átomo central (íon metálico) que eles ocupam. Os agentes quelantes mais utilizados em IMAC podem ocupar dois, três, quatro ou cinco sítios de ligação, sendo chamados de bidentados, tridentados, tetradentados e pentadentados, respectivamente(CHAGA, 2001;MOONEY et al, 2015).O IDA é um agente quelante tridentado e um dos mais utilizados na IMAC. De acordo com as constantes de dissociação dos grupos carboxila existentes na estrutura da molécula de IDA, infere-se que a valores de pH baixos (abaixo do pKa dos grupos carboxílicos), algumas moléculas de IDA têm seus grupos protonados, o que pode afetar o número de sítios de ligação que essa molécula ocupa (PORATH;OLIN, 1983), exemplificando a importância das condições do meio para a IMAC.…”
unclassified
“…De acordo com as constantes de dissociação dos grupos carboxila existentes na estrutura da molécula de IDA, infere-se que a valores de pH baixos (abaixo do pKa dos grupos carboxílicos), algumas moléculas de IDA têm seus grupos protonados, o que pode afetar o número de sítios de ligação que essa molécula ocupa (PORATH;OLIN, 1983), exemplificando a importância das condições do meio para a IMAC. Agentes tridentados macrocíclicos foram propostos nas últimas décadas para purificação de proteínas recombinantes com cauda de histidina, tal como o 1,4,7-triazaciclononano (TACN) HEARN, 2011;MOONEY et al, 2015).Agentes quelantes bidentados e tetradentados também têm sido empregados para o fracionamento de proteínas. O bidentado 8-hidroxiquinolina e os tetradentados ácido aspártico carboximetilado (CM-Asp), TREN e NTA foram estudados e analisados para aplicações em cromatografia de afinidade (GABERC-POREKAR;MENART, 2001; ZACHARIOU; HEARN, 2000).…”
unclassified