Observations of mycotal species growth on the rainbow trout eggs (Oncorhynchus mykiss)
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La acuicultura es una actividad económica con gran crecimiento en los últimos años. Tanto a nivel regional como mundial, los productos de acuicultura se diversificaron y aumentaron considerablemente sus volúmenes de producción. En este contexto, las técnicas de cultivo intensivo promueven el surgimiento de enfermedades que implican un problema importante para la piscicultura de aguas continentales. En particular, las oomicosis (también llamadas “saprolegniasis”) son causa de mortalidad y pérdidas económicas, principalmente en los países donde el cultivo de salmónidos se encuentra más desarrollado. Estas infecciones son causadas por Oomycetes acuáticos del orden Saprolegniales que afectan a los peces de cría en todos los estadios de su ciclo de vida y resultan muchas veces letales sin tratamientos adecuados. Además de causar serios problemas en los sistemas de producción, las oomicosis fueron observadas en peces silvestres e inclusive están implicadas en la declinación de poblaciones naturales de salmónidos y en brotes asociados a situaciones de estrés ambiental. En la piscicultura del CEAN, Junín de los Andes, se realiza la cría y reproducción de salmónidos (trucha arcoíris, Oncorhynchus mikiss; trucha marrón, Salmo trutta y salmón del Atlántico, Salmo salar) y, de manera experimental, del pejerrey patagónico (Odontesthes hatcheri). Tanto en la incubación de ovas como en otras etapas del ciclo de cría de estos peces, comúnmente se observan infecciones oomicóticas, que causan pérdidas en la producción y deben ser combatidas mediante el uso de tratamientos preventivos y/o terapéuticos. Este trabajo de tesis tiene como objetivo ampliar el conocimiento sobre Oomycetes que afectan a los peces de cría en estaciones de piscicultura, estudiar aspectos patogénicos y, además, los efectos de la interacción con Flavobacterium psychrophilum, una bacteria patógena de salmónidos. Por otro lado, y con fines de implementación en tratamientos de control, se evalúa la capacidad antioomicótica de ciertas sustancias de origen vegetal frente a algunas cepas aisladas durante este estudio. El capítulo 1, se dedicó al aislamiento e identificación de Oomycetes asociados a ovas, peces y materia orgánica de la piscicultura del CEAN. Se colectaron ovas de salmónidos y pejerrey patagónico infectadas naturalmente en los sistemas de incubación. Mientras que, en los estanques de cría, se recolectaron peces moribundos (trucha arcoíris y pejerrey patagónico) que presentaban micelio en la superficie corporal. La identificación se realizó mediante características morfológicas y moleculares. En este estudio, se aislaron e identificaron morfológicamente once taxones pertenecientes a los órdenes Saprolegniales y Leptomitales del phylum Oomycota, de los cuales, Saprolegnia diclina, S. ferax, S. parasitica, S. glomerata, Newbya dichotoma, Scoliolegnia asterophora y Leptomitus lacteus fueron registradas en Argentina con anterioridad, mientras que Saprolegnia aenigmatica, Achlya ambisexualis, Pythiopsis cymosa y P. humphreyana representan nuevas citas para nuestro país. Por otra parte, mediante los estudios moleculares, se logró la amplificación de la región Cox2 del ADN mitocondrial y se obtuvieron 62 secuencias que fueron incorporadas al proyecto “OOMAC Oomycota de Argentina y Chile” de la base de datos de BOLD SYSTEMS. En base al análisis de similitud con secuencias depositadas en GenBank y a los análisis filogenéticos, se logró agrupar a 56 de las secuencias y asignarlas a los taxones Saprolegnia parasitica, S. ferax, S. diclina, S. aenigmatica y Saprolegnia sp. Finalmente, y de acuerdo a los agrupamientos realizados en el análisis molecular, se estimó la abundancia relativa de cada taxón por sustrato de aislamiento. En el capítulo 2, se evaluaron la capacidad infectiva y los efectos patológicos de algunas de las cepas aisladas en los muestreos del capítulo anterior. Se realizaron infecciones experimentales sobre ovas y juveniles de trucha arcoíris y pejerrey patagónico donde se consideraron las tasas de infección, mortalidad y efectos histológicos. Los principales resultados indican que las zoosporas de cepas identificadas como S. parasitica, S. ferax, S. diclina, S. glomerata, Saprolegnia spp., Leptomitus lacteus y Achlya sp. tienen la capacidad de colonizar ovas muertas de trucha arcoíris, sin embargo, no generan un aumento significativo de la mortalidad de las ovas vivas. Mientras que, el contacto con inóculos infectivos de Saprolegnia spp., S. glomerata, S. parasitica, S. diclina y S. ferax generó infección y mortalidad en las ovas vivas, aunque esto fue dependiente de la cantidad de los inóculos. Por otra parte, las ovas muertas de pejerrey patagónico también fueron colonizadas por zoosporas de S. parasitica, S. diclina y S. ferax, sin embargo, las ovas vivas fueron un sustrato donde las esporas germinaron y desarrollaron pequeñas hifas, sin causar incrementos significativos en la mortalidad. Estos resultados sugieren que el corion de las ovas representa una barrera de defensa efectiva frente a la infección por las zoosporas de Oomycetes a la vez que los estadios vegetativos (hifas) son los causantes de los incrementos en la mortalidad y la propagación de los Oomycetes en los sistemas de incubación de ovas. En este estudio, solamente los peces sometidos a un tratamiento previo de abrasión fueron infectados por las zoosporas de S. parasitica, S. diclina y S. ferax. Las infecciones causaron, además, un aumento significativo de la mortalidad. Estos resultados sugieren que el tegumento representa una línea de defensa eficaz contra la infección por las zoosporas de Oomycetes. En estos ensayos, se observaron diferencias inter e intraespecíficas en las tasas de infección y mortalidad. A nivel histológico, se observó que S. diclina y S. ferax causan alteraciones a nivel del tegumento y capa muscular, y una débil respuesta inflamatoria. Por otra parte, en el ensayo con larvas de pejerrey patagónico, se observó que los componentes de la dieta pueden incidir en la infección y mortalidad generada por zoosporas de S. diclina. Las observaciones histológicas sugieren, en este caso, que las infecciones se originaron a nivel del tracto digestivo, desde donde las hifas se expandieron hacia el resto del cuerpo. En el capítulo 3, se evaluó el efecto de la infección por Flavobacterium psychrophilum como un probable factor inductor de la infección y la mortalidad por Saprolegnia parasitica en juveniles de trucha arcoíris. Se estudiaron, además, aspectos patológicos y parámetros inmunológicos y de estrés oxidativo. Se evaluaron la predisposición a la infección por zoosporas de S. parasitica en peces previamente infectados con F. psychrophilum y posibles efectos sinérgicos o antagónicos. Para ello, a partir de peces naturalmente infectados, se aislaron e identificaron distintas cepas de F. psychrophilum, se seleccionó una de éstas y se la utilizó, junto con una cepa de S. parasitica en un ensayo in vivo de exposición consecutiva. Se midieron las tasas de infección y mortalidad, y se realizaron observaciones clínicas y análisis histológicos. Se midió el contenido de inmunoglobulinas en el mucus, el recuento diferencial de leucocitos y, a nivel hepático, el contenido de indicadores del balance oxidativo y de daño a lípidos. F. psychrophilum generó alteraciones patológicas principalmente a nivel del tegumento y la musculatura, sin embargo, la infección bacteriana no promovió la infección por S. parasitica y no se observó un efecto sinérgico en la mortalidad ni a nivel histopatológico. Flavobacterium psychrophilum generó el incremento en los porcentajes relativos de monocitos y trombocitos con forma de huso, lo cual puede indicar una activación de la respuesta inmune inespecífica. La exposición a zoosporas de S. parasitica incrementó el porcentaje relativo de linfocitos, sin embargo, esta respuesta no fue evidente en los peces infectados previamente con F. psychrophilum. Los descensos en los niveles de inmunoglobulinas en mucus de peces infectados por F. psychrophilum también sugieren una inhibición de la respuesta inmune adaptativa. La infección por F. psychrophilum disminuyó el pool de glutatión total en los hepatocitos y afectó el balance hacia el estado antioxidante. Mientras que la exposición a S. parasitica produjo un aumento en los niveles de daño oxidativo a lípidos sin modificar los otros parámetros del balance oxidativo estudiados en el hígado. No se observaron efectos sinérgicos entre F. psychrophilum y S. parasitica sobre los indicadores de daño oxidativo. Finalmente, en el capítulo 4 se evaluó in vitro la acción antioomicótica del eugenol, el isoeugenol, el timol y el guaiacol frente a estadios vegetativos y zoosporas de una cepa de S. diclina, una de S. ferax y dos cepas de S. parasitica. En estos ensayos, se emplearon las técnicas de microatmósfera y dilución en placas para la determinación de la concentración inhibitoria total (CIT) y la concentración letal (CL) de estas sustancias frente a los Oomycetes. Además, según el caso, se estimaron la concentración inhibitoria 90 (CI90) y la concentración inhibitoria 50 (CI50) mediante modelos de regresión no lineal. Los resultados mostraron que los estadios vegetativos y las zoosporas de S. parasitica, S. ferax y S. diclina fueron sensibles, en mayor o menor medida, al eugenol, isoeugenol, timol y guaiacol. El timol y el isoeugenol fueron las sustancias más efectivas en reducir o inhibir el crecimiento oomicótico y podrían ser consideradas en futuros estudios de búsqueda de productos antioomicóticos alternativos para su aplicación en acuicultura.
La acuicultura es una actividad económica con gran crecimiento en los últimos años. Tanto a nivel regional como mundial, los productos de acuicultura se diversificaron y aumentaron considerablemente sus volúmenes de producción. En este contexto, las técnicas de cultivo intensivo promueven el surgimiento de enfermedades que implican un problema importante para la piscicultura de aguas continentales. En particular, las oomicosis (también llamadas “saprolegniasis”) son causa de mortalidad y pérdidas económicas, principalmente en los países donde el cultivo de salmónidos se encuentra más desarrollado. Estas infecciones son causadas por Oomycetes acuáticos del orden Saprolegniales que afectan a los peces de cría en todos los estadios de su ciclo de vida y resultan muchas veces letales sin tratamientos adecuados. Además de causar serios problemas en los sistemas de producción, las oomicosis fueron observadas en peces silvestres e inclusive están implicadas en la declinación de poblaciones naturales de salmónidos y en brotes asociados a situaciones de estrés ambiental. En la piscicultura del CEAN, Junín de los Andes, se realiza la cría y reproducción de salmónidos (trucha arcoíris, Oncorhynchus mikiss; trucha marrón, Salmo trutta y salmón del Atlántico, Salmo salar) y, de manera experimental, del pejerrey patagónico (Odontesthes hatcheri). Tanto en la incubación de ovas como en otras etapas del ciclo de cría de estos peces, comúnmente se observan infecciones oomicóticas, que causan pérdidas en la producción y deben ser combatidas mediante el uso de tratamientos preventivos y/o terapéuticos. Este trabajo de tesis tiene como objetivo ampliar el conocimiento sobre Oomycetes que afectan a los peces de cría en estaciones de piscicultura, estudiar aspectos patogénicos y, además, los efectos de la interacción con Flavobacterium psychrophilum, una bacteria patógena de salmónidos. Por otro lado, y con fines de implementación en tratamientos de control, se evalúa la capacidad antioomicótica de ciertas sustancias de origen vegetal frente a algunas cepas aisladas durante este estudio. El capítulo 1, se dedicó al aislamiento e identificación de Oomycetes asociados a ovas, peces y materia orgánica de la piscicultura del CEAN. Se colectaron ovas de salmónidos y pejerrey patagónico infectadas naturalmente en los sistemas de incubación. Mientras que, en los estanques de cría, se recolectaron peces moribundos (trucha arcoíris y pejerrey patagónico) que presentaban micelio en la superficie corporal. La identificación se realizó mediante características morfológicas y moleculares. En este estudio, se aislaron e identificaron morfológicamente once taxones pertenecientes a los órdenes Saprolegniales y Leptomitales del phylum Oomycota, de los cuales, Saprolegnia diclina, S. ferax, S. parasitica, S. glomerata, Newbya dichotoma, Scoliolegnia asterophora y Leptomitus lacteus fueron registradas en Argentina con anterioridad, mientras que Saprolegnia aenigmatica, Achlya ambisexualis, Pythiopsis cymosa y P. humphreyana representan nuevas citas para nuestro país. Por otra parte, mediante los estudios moleculares, se logró la amplificación de la región Cox2 del ADN mitocondrial y se obtuvieron 62 secuencias que fueron incorporadas al proyecto “OOMAC Oomycota de Argentina y Chile” de la base de datos de BOLD SYSTEMS. En base al análisis de similitud con secuencias depositadas en GenBank y a los análisis filogenéticos, se logró agrupar a 56 de las secuencias y asignarlas a los taxones Saprolegnia parasitica, S. ferax, S. diclina, S. aenigmatica y Saprolegnia sp. Finalmente, y de acuerdo a los agrupamientos realizados en el análisis molecular, se estimó la abundancia relativa de cada taxón por sustrato de aislamiento. En el capítulo 2, se evaluaron la capacidad infectiva y los efectos patológicos de algunas de las cepas aisladas en los muestreos del capítulo anterior. Se realizaron infecciones experimentales sobre ovas y juveniles de trucha arcoíris y pejerrey patagónico donde se consideraron las tasas de infección, mortalidad y efectos histológicos. Los principales resultados indican que las zoosporas de cepas identificadas como S. parasitica, S. ferax, S. diclina, S. glomerata, Saprolegnia spp., Leptomitus lacteus y Achlya sp. tienen la capacidad de colonizar ovas muertas de trucha arcoíris, sin embargo, no generan un aumento significativo de la mortalidad de las ovas vivas. Mientras que, el contacto con inóculos infectivos de Saprolegnia spp., S. glomerata, S. parasitica, S. diclina y S. ferax generó infección y mortalidad en las ovas vivas, aunque esto fue dependiente de la cantidad de los inóculos. Por otra parte, las ovas muertas de pejerrey patagónico también fueron colonizadas por zoosporas de S. parasitica, S. diclina y S. ferax, sin embargo, las ovas vivas fueron un sustrato donde las esporas germinaron y desarrollaron pequeñas hifas, sin causar incrementos significativos en la mortalidad. Estos resultados sugieren que el corion de las ovas representa una barrera de defensa efectiva frente a la infección por las zoosporas de Oomycetes a la vez que los estadios vegetativos (hifas) son los causantes de los incrementos en la mortalidad y la propagación de los Oomycetes en los sistemas de incubación de ovas. En este estudio, solamente los peces sometidos a un tratamiento previo de abrasión fueron infectados por las zoosporas de S. parasitica, S. diclina y S. ferax. Las infecciones causaron, además, un aumento significativo de la mortalidad. Estos resultados sugieren que el tegumento representa una línea de defensa eficaz contra la infección por las zoosporas de Oomycetes. En estos ensayos, se observaron diferencias inter e intraespecíficas en las tasas de infección y mortalidad. A nivel histológico, se observó que S. diclina y S. ferax causan alteraciones a nivel del tegumento y capa muscular, y una débil respuesta inflamatoria. Por otra parte, en el ensayo con larvas de pejerrey patagónico, se observó que los componentes de la dieta pueden incidir en la infección y mortalidad generada por zoosporas de S. diclina. Las observaciones histológicas sugieren, en este caso, que las infecciones se originaron a nivel del tracto digestivo, desde donde las hifas se expandieron hacia el resto del cuerpo. En el capítulo 3, se evaluó el efecto de la infección por Flavobacterium psychrophilum como un probable factor inductor de la infección y la mortalidad por Saprolegnia parasitica en juveniles de trucha arcoíris. Se estudiaron, además, aspectos patológicos y parámetros inmunológicos y de estrés oxidativo. Se evaluaron la predisposición a la infección por zoosporas de S. parasitica en peces previamente infectados con F. psychrophilum y posibles efectos sinérgicos o antagónicos. Para ello, a partir de peces naturalmente infectados, se aislaron e identificaron distintas cepas de F. psychrophilum, se seleccionó una de éstas y se la utilizó, junto con una cepa de S. parasitica en un ensayo in vivo de exposición consecutiva. Se midieron las tasas de infección y mortalidad, y se realizaron observaciones clínicas y análisis histológicos. Se midió el contenido de inmunoglobulinas en el mucus, el recuento diferencial de leucocitos y, a nivel hepático, el contenido de indicadores del balance oxidativo y de daño a lípidos. F. psychrophilum generó alteraciones patológicas principalmente a nivel del tegumento y la musculatura, sin embargo, la infección bacteriana no promovió la infección por S. parasitica y no se observó un efecto sinérgico en la mortalidad ni a nivel histopatológico. Flavobacterium psychrophilum generó el incremento en los porcentajes relativos de monocitos y trombocitos con forma de huso, lo cual puede indicar una activación de la respuesta inmune inespecífica. La exposición a zoosporas de S. parasitica incrementó el porcentaje relativo de linfocitos, sin embargo, esta respuesta no fue evidente en los peces infectados previamente con F. psychrophilum. Los descensos en los niveles de inmunoglobulinas en mucus de peces infectados por F. psychrophilum también sugieren una inhibición de la respuesta inmune adaptativa. La infección por F. psychrophilum disminuyó el pool de glutatión total en los hepatocitos y afectó el balance hacia el estado antioxidante. Mientras que la exposición a S. parasitica produjo un aumento en los niveles de daño oxidativo a lípidos sin modificar los otros parámetros del balance oxidativo estudiados en el hígado. No se observaron efectos sinérgicos entre F. psychrophilum y S. parasitica sobre los indicadores de daño oxidativo. Finalmente, en el capítulo 4 se evaluó in vitro la acción antioomicótica del eugenol, el isoeugenol, el timol y el guaiacol frente a estadios vegetativos y zoosporas de una cepa de S. diclina, una de S. ferax y dos cepas de S. parasitica. En estos ensayos, se emplearon las técnicas de microatmósfera y dilución en placas para la determinación de la concentración inhibitoria total (CIT) y la concentración letal (CL) de estas sustancias frente a los Oomycetes. Además, según el caso, se estimaron la concentración inhibitoria 90 (CI90) y la concentración inhibitoria 50 (CI50) mediante modelos de regresión no lineal. Los resultados mostraron que los estadios vegetativos y las zoosporas de S. parasitica, S. ferax y S. diclina fueron sensibles, en mayor o menor medida, al eugenol, isoeugenol, timol y guaiacol. El timol y el isoeugenol fueron las sustancias más efectivas en reducir o inhibir el crecimiento oomicótico y podrían ser consideradas en futuros estudios de búsqueda de productos antioomicóticos alternativos para su aplicación en acuicultura.
Morphological and phylogenetic analyses of Saprolegniales (Oomycota) reveal taxonomic and nomenclatural novelties
No abstract
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