Obtenção das quinases dependentes de ciclinas CDK9 e CDK11 humanas utilizando um sistema bacteriano de expressão (E. coli)

Abstract

Exemplar revisadoO exemplar original encontra-se em acervo reservado na Biblioteca do IQSC-USP São Carlos 2015 DEDICATÓRIADedico este trabalho à minha mãe, Tina, e ao meu avô, Newton, que com seu amor, paciência, e apoio incondicionais tornaram tudo possível. AGRADECIMENTOS• À minha orientadora, Prof.ª Fernanda Canduri, pela oportunidade de trabalho, paciência, e confiança em mim depositada.• A todos os colegas do meu grupo e de outros grupos de pesquisa, que contribuíram para a realização deste trabalho, especialmente à Cíntia, Bruna, Nathália, Juliana, Buana e Reetesh pela ajuda e troca de experiências.• À minha família, por todo o incentivo e apoio com os quais sempre pude contar.• Aos amigos queridos que, de perto ou de longe, estiveram ao meu lado em todos os momentos da jornada.• Às agências de fomento CNPq e Fapesp, pela bolsa de auxílio e financiamento do projeto de pesquisa, respectivamente. EPÍGRAFE"Não foi sem intenção que a engenhosa Natureza uniu a doçura do mel ao ferrão da abelha"− Baltasar Gracián, A Arte da Prudência, século XVII. RESUMOAs CDKs 9 e 11 fazem parte da subfamília de CDKs transcricionais, e portanto desempenham papéis de controle na dinâmica atividade de síntese e processamento do RNA mensageiro pela RNA Polimerase II. Devido à sua capacidade de modular individualmente a atividade dos complexos de transcrição da RNAP II, estas quinases assumem uma grande importância para a regulação da expressão gênica em células eucarióticas. Casos de desregulação da atividade de CDKs transcricionais têm sido frequentemente relacionados a diversas patologias humanas graves, incluindo vários tipos de câncer e também a AIDS (em razão do papel essencial desempenhado pela CDK9 na replicação do HIV). O objetivo deste trabalho é a obtenção das CDKs humanas 9 e 11 através da expressão heteróloga em Escherichia coli, buscando o aperfeiçoamento de métodos para produzir estas enzimas em quantidade e pureza suficientes para aplicação em estudos estruturais. A utilização de um sistema bacteriano oferece muitas vantagens práticas, como a simplicidade da técnica, baixo custo, altos níveis de expressão, e elevado rendimento na purificação do produto. No entanto, a obtenção de quinases humanas ativas a partir de E. coli sempre representou um desafio experimental, devido aos problemas comumente associados à expressão heteróloga.Os resultados apresentados aqui demonstram a possibilidade de se obter a CDK9 humana enzimaticamente ativa pelo reenovelamento in vitro da proteína expressa pela bactéria na forma de corpos de inclusão, após etapas de solubilização e purificação em condições desnaturantes. Por outro lado, a CDK11 humana só pôde ser obtida em uma versão encurtada, consistindo apenas no seu domínio quinase, devido à forte inibição que um trecho N-terminal da sequência mostrou exercer sobre a expressão da proteína. Assim, este trabalho fornece exemplos de como é possível superar algumas das adversidades comuns da expressão heteróloga a fim de se obter CDKs humanas ativas empregando o sistema bacteriano. of canc...

Obtenção e caracterização estrutural da proteí­na humana Quinase Dependente de Ciclina 9 (CDK9) utilizando o sistema bacteriano de >i<Escherichia coli>/i<

“…Apesar das dificuldades encontradas na expressão de enzimas humanas biologicamente ativas em sistemas bacterianos, o grupo de pesquisa possui ótimos resultados preliminares (LEOPOLDINO et al, 2006;SANTOS, 2015 et al (2006), este projeto propôs a obtenção da CDK9 a partir de Escherichia coli, sem fusão a outras proteínas, envolvendo métodos simples, de baixo custo, alto nível de expressão e fácil purificação.…”

SCI1 e NtCDKG;2 atuam no ciclo celular, no processamento de RNAs e no desenvolvimento floral em Nicotiana tabacum

“…heteróloga de CDK11, a proteína homóloga de NtCDKG;2 em H. sapiens(FERREIRA, 2016;LUBINI, 2016). Segundo o autor, só foi possível expressar CDK11 em E. coli sem a sua porção N-terminal, a qual parece desestabilizar a expressão da versão completa(SANTOS, 2015). 1999), sua abundância pode ter dificultado a detecção da forma completa de NtCDKG;2.…”