Latar Belakang: Growol adalah makanan tradisional Kulon Progo, Yogyakarta. Fermentasi singkong menjadi growol terbukti dapat menurunkan kadar gula total, gula reduksi, dan sukrosa, serta meningkatkan kadar serat pangan yang berpotensi sebagai sumber prebiotik. Potensi prebiotik tepung growol sudah dilakukan pada Lactobacillus sp. Potensi prebiotik tepung growol perlu dilakukan pada bakteri probiotik lain. Tujuan: Penelitian ini bertujuan untuk menilai potensi prebiotik tepung growol yang mendukung pertumbuhan dan aktivitas bakteri probiotik, seperti Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, dan Lactobacillus acidophilus, dibandingkan dengan bakteri Escherichia coli. Metode: Bahan yang digunakan adalah tepung growol sebagai substrat kontrol bahan baku, inulin sebagai kontrol prebiotik dan glukosa sebagai kontrol substrat. Pengujian dilakukan secara in vitro pada Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, dan Escherechia coli. Analisis in vitro dilakukan dengan metode Huebner dengan mengukur pertumbuhan bakteri pada masing-masing substrat pada jam ke–0 dan jam 24–48. Analisis data dilakukan secara deskriptif untuk membandingkan skor aktivitas prebiotik antara tepung growol dengan inulin. Hasil: Skor aktivitas prebiotik tepung growol pada Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, dan Lactobacillus acidophilus dibanding Escherichia coli adalah 0,19; 0,06; dan -0,07 secara berurutan. Skor aktivitas prebiotik inulin pada Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, dan Lactobacillus acidophilus dibanding Escherichia coli adalah 0,64; 0,28; dan 0,33 secara berurutan. Kesimpulan: Tepung growol berpotensi sebagai sumber prebiotik yang dapat meningkatkan pertumbuhan aktivitas bakteri probiotik khususnya Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophilus, meskipun hasilnya tidak lebih baik dari inulin.