Gen calpastatin (CAST) berperan dalam mengontrol sifat kualitas daging. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui keragaman gen calpastatin tiga jenis ayam kampung yang berbeda. Penelitian ini menggunakan motode PCR-RFLP untuk mengamplifikasi fragmen DNA genom gen CAST. Penelitian ini dilaksanakan di Kandang Peternakan CV. Bittara Wanua di Kabupaten Soppeng dan Laboratorium Bioteknologi Terpadu Universitas Hasanuddin. Jumlah sampel yangg digunakan sebanyak 45 ekor dari tiga jenis ayam kampung yang berbeda, yaitu Ayam KUB, ayam Merawang, dan ayam kampung in ovo feeding. Hasil penelitian menunjukkan bahwa genotipe ayam kampung berupa AA dan AG, dengan frekuensi alel dominan A. Gen CAST pada ayam kampung in ovo feeding bersifat polimorfik (frekuensi alel A = 0,93; G = 0,07), sedangkan ayam KUB dan ayam Merawang bersifat monomorfik (frekuensi alel A = 0,97; G = 0,03 pada ayam KUB dan frekuensi alel A = 1,00; G = 0,00 pada ayam Merawang). Nilai Ho dan He ayam kampung in ovo feeding masing-masing sebesar 0,133 dan 0,1289. Ayam kampung in ovo feeding berada dalam keseimbangan Hukum Herdy-Weinberg dengan nilai X2 = 0,0370