Recientemente un gran número de investigaciones a lo largo del mundo se han enfocado en estudiar el impacto de la contaminación del agua en la salud humana, evidenciando potenciales problemas de salud pública y efectos adversos al medio ambiente. Los factores antropogénicos han sido identificados como una de las principales causas de la contaminación de los recursos hídricos, en especial, el uso excesivo de plaguicidas, compuestos químicos utilizados en actividades agrícolas para mantener libres de maleza e insectos los cultivos, contrarrestando la creciente demanda de producción de alimentos. Siendo el estado de Jalisco el mayor productor agroalimentario de México en los últimos años, el objetivo de la presente investigación fue el monitoreo y determinación de 17 plaguicidas en 13 puntos diferentes de la cuenca del río Ayuquila, Jalisco durante los años 2015, 2016 y 2017. Entre los principales hallazgos se encontró la presencia de plaguicidas en todos los puntos de muestreo con frecuencias de detección en un rango del 10 – 100%, siendo el malatión el pesticida mayormente detectado durante los tres años del estudio. Finalmente, se calcularon los riesgos al medio ambiente (RQi) y la salud humana (HQ) demostrando que las concentraciones detectadas para diazinon, dimetoato, emamectina y malatión alcanzaron valores significativos (≥1) para representar un potencial riesgo a la población. Las concentraciones relativamente altas que fueron encontradas en este estudio sugieren que la presencia y alta tasa de prevalencia de plaguicidas en agua del río Ayuquila podría ser derivado de un intensivo aumento en el uso de mezclas de estos en las zonas agrícolas de la región.