pH‐abhängige Dimerisierung und salzabhängige Stabilisierung der N‐terminalen Domäne von Abseilfaden‐Spinnenseide – Details zur Initiation des Assemblierungsprozesses

Abstract

Die Assemblierung von Abseilfaden("dragline")-Spinnenseide wird durch die relativ kleinen C-und N-terminalen Domänen der Spidroine kontrolliert. [1][2][3][4][5][6] Die außergewöhnli-chen mechanischen Eigenschaften von Spinnenseide sind das Ergebnis einer streng kontrollierten Anlagerung von Polyalanin-und Poly(glycinalanin)-Wiederholungseinheiten (polyA bzw. polyGA), die sich in der Seidensequenz mit GGX-und GPGXX-Einheiten abwechseln, welche dem Faden die Elastizität verleihen. [4,5,7] Die korrekte Assemblierung dieser polyA/polyGA-Sequenzen zu mikrokristallinen Strukturbereichen wird durch den pH-Wert, die Salzkonzentration und eine durch Scherkräfte induzierte partielle Entfaltung der dimeren C-terminalen Domäne kontrolliert. [8] Der N-terminalen Domäne wurde ebenso eine wichtige Rolle für die Faserassemblierung in einer pH-abhängigen Weise zugeschrieben.[9] Mithilfe von NMR-Spektroskopie und Lichtstreuungsmessungen zeigen wir hier, dass die N-terminale Domäne eines Seidenproteins aus der großen Spinndrüse der Schwarzen Witwe (Latrodectus hesperus) im neutralen pH-Bereich -wie er in der Spinndrüse vorkommthauptsächlich als Monomer vorliegt. Die leichte Tendenz zur Dimerisierung kann durch die natürliche Salzkonzentration inhibiert werden. Bei niedrigerem pH-Wert (wie für die Faserassemblierung nötig) bildet die N-terminale Domäne jedoch Dimere. Der für die Faserbildung sehr wichtige Assemblierungsprozess der N-terminalen Domäne wird also hauptsächlich durch eine Senkung des pH-Werts kontrolliert. Die Kristallstruktur der N-terminalen Domäne zeigt ein Homodimer mit einer antiparallelen Orientierung der beiden Untereinheiten. Die hier gezeigten NMR-Daten ergänzen dieses Bild durch neue Erkenntnisse zur Regulation und Funktion dieser Domäne, die zur Bildung langer Seidenfäden nötig ist.Spinnenseiden-Abseilfäden bestehen aus zwei Proteinen mit jeweils verschiedenen konservierten N-terminalen Domänen (SI-Abbildung 1 in den Hintergrundinformationen). Für unsere strukturelle Charakterisierung wurden die NTermini der Seidenproteine aus der großen Spinndrüse (major ampullate gland, MA) von Latrodectus hesperus verwendet (N1 und N2, SI-Tabelle 1). In Übereinstimmung mit einem früheren Bericht [10] konnten wir mithilfe von Zirkulardichroismus(CD)-Spektroskopie zeigen, dass beide Konstrukte einen hohen a-Helix-Anteil und ausreichend hohe thermische Stabilität aufweisen (SI-Abbildung 2). N1 ist etwas stabiler als N2, weshalb dieses für eine NMR-spektroskopische Charakterisierung verwendet wurde.Mit einem Satz von Tripelresonanz-Experimenten konnten die Proteinrückgratatome von 97 % aller Aminosäure-reste (128 von 132) und außerdem fast alle Proteinseiten-