Un método rápido, sensible y preciso por Cromatografía Líquida de Alta Resolución fue desarrollado y validado para la determinación de los niveles de N-3-metoxibencil-linoleamida en cerebro de ratas Sprague Dawley. Durante la preparación de la muestra se usó acetonitrilo como solvente de extracción y N-bencil-palmitamida como estándar interno. El analito se separó en una columna Chromolith® Performance con elución isocrática de acetonitrilo-agua ultrapura (80:20, v/v) a 1.0 mL/min y a 40°C. La detección se realizó utilizando un detector de arreglo de diodos a una longitud de onda de 205 nm. La selectividad del método se confirmó por la ausencia de interferentes endógenos. El método desarrollado se usó para construir curvas de calibración lineales en el rango de concentración de 250 y 10 000 ng/mL, (R2 ≥ 0.9900). Usando 500 μg de homogeneizado de cerebro, el límite inferior de cuantificación validado fue de 250.0 ng/mL. La exactitud y precisión intra e inter-día estuvieron dentro del 15% de las concentraciones nominales. Asimismo, el analito y su estándar interno demostraron ser estables durante el almacenamiento, la preparación de muestra y el análisis cromatográfico.