Resumen. Introducción. Las infecciones de transmisión sexual (ITS) son y seguirán siendo un serio problema de salud pública en todo el mundo según los datos de la OMS, con el agravante que la mayoría de los casos son asintomáticos y, además, no existe otro reservorio distinto al humano. El diagnóstico se puede realizar con pruebas tradicionales y moleculares, estas últimas incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), de las cuales existen varios tipos, entre ellas, la PCR múltiple que tiene la capacidad de detectar ITS polimicrobianas a partir de una sola muestra. El objetivo de este estudio fue establecer cuáles fueron las infecciones de transmisión sexual más frecuentes en diferentes grupos de pacientes, así como determinar la utilidad del uso de la técnica de PCR múltiple en el diagnóstico de las ITS. Metodología. Se trata de un estudio observacional de corte transversal realizado entre los años 2021 y 2022 con pacientes que acudieron al servicio de diagnóstico del Laboratorio Clínico VID por sospecha de ITS. Las muestras recolectadas fueron evaluadas utilizando una prueba comercial basada en la técnica de PCR múltiple e hibridación. Las muestras procesadas fueron: orina e hisopados de endocérvix, uretra, recto, faringe y úlceras. Resultados. Se estudiaron 1.027 pacientes, de estos, 228 (22,2 %) fueron positivos para diferentes agentes de trasmisión sexual, distribuidos así: 50 (21,9 %) mujeres, 129 (56,6 %) hombres heterosexuales y 49 (21,5 %) hombres que tenían sexo con hombres (HSH). La edad promedio de las mujeres fue 30 años, y la de ambos grupos de hombres fue 36 años. Los microorganismos más frecuentemente identificados en mujeres fueron: C. trachomatis (A-K) en 28,6 %, seguido de virus herpes simplex tipo 2 (VHS-2) en 26,8 % y N. gonorrhoeae en 17,9 %. En hombres heterosexuales fueron C. trachomatis (A-K) en 37,5 %, N. gonorrhoeae en 21,5 % y VHS-2 en 18,7 %. En HSH fueron C. trachomatis (L1-L3) en 32,7 %, seguido de N. gonorrhoeae en 27,6 %, y de C. trachomatis (A-K) y VHS-2, ambos en 13,8 %. En 11 hombres heterosexuales, 8 HSH y en 6 mujeres, se identificó infección polimicrobiana. Conclusiones. C. trachomatis (A-K) fue el microorganismo más prevalente causante de ITS, seguido de N. gonorrhoeae en ambos grupos de hombres, y de VHS-2 en las mujeres, muy similar a lo reportado a nivel mundial. La prueba de PCR múltiple permite la detección de infecciones polimicrobianas comúnmente asociadas a ITS y el diagnóstico es preciso y confiable, incluso en pacientes asintomáticos.