Producción a escala piloto (10 L) y caracterización de un concentrado enzimático de rPOXA 1B para la remoción de colorantes

Abstract

Introducción. Las lacasas (E.C. 1.10.3.2) son enzimas oxidoreductasas multicobre de gran importancia e interés biotecnológico, debido a su alto potencial oxidativo y a que durante la catálisis generan H₂O en lugar de H2O2. Las lacasas son útiles para remover (a través de la decoloración) colorantes sintéticos, oxidar compuestos fenólicos y degradar pesticidas, entre otros. No obstante, para asumir la producción, comercialización y uso a gran escala de las lacasas, es importante conocer la estabilidad y la vida media de la enzima (t1/2); lo que permitiría proponer condiciones de uso y almacenamiento, ajustadas a las características y origen de cada enzima. Objetivos. Producir a escala de 10 L, la enzima recombinante rPOXA 1B de Pleurotus ostreatus expresada en Pichia pastoris para la remoción de color en agua residual coloreada de laboratorio (CLWW) y conocer la estabilidad a tiempo real y acelerada de la misma. Metodología. Se utilizó la cepa recombinante Pichia pastoris X33/pGAPZaA-LaccPost-Stop (Clon 1) para la expresión de la lacasa POXA 1B (rPOXA 1B) de Pleurotus ostreatus. Se estandarizó la técnica para la detección de la actividad enzimática a través de dos diseños experimentales, un “D-optimal Design” y un “D-optimal Design (irregular)” para identificar las mejores condiciones de deteción en tampón acetato y tampón citrato respectivamente. El complejo enzima-sustrato fue evaluada mediante análisis de acoplamiento molecular empleando Autodock Vina. Luego se llevó a cabo la producción de 3 lotes de rPOXA 1B (L1, L3 y L4) en biorreactor a escala de 10 L con volumen efectivo de trabajo (VET) de 6 L, empleando un medio de cultivo previamente mejorado en nuestro grupo de investigación. Se optimizó (a escala de laboratorio) un medio de cultivo de bajo costo a través de la implementación de tres diseños experimentales; dos “Central Composite Design” (CCD-1 y CCD-2), seguidos de un “One Factor Experimental Design” (OFED). Se demostró (a escala de laboratorio) el efecto de la adición de metanol (CH3OH) después del agotamiento de la glucosa (C6 H12O6) para lo cual se utilizaron cuatro medios de cultivo diferentes con y sin adición de CH3OH. Para los estudios de estabilidad a tiempo real (RTS) con duración de 1 año, se utilizó parte de los concentrados enzimáticos (impuros y sin preservantes) provenientes de los lotes L1, L3 y L4, para lo cual se implementaron cinco temperaturas teóricas, -30, 4, 25, 30, 35 y 40 °C, [243.15, 277.15, 298.15, 303.15, 308.15 y 313.15 K] y utilizando la ecuación de Arrhenius se evaluó la estabilidad acelerada (AS) del concentrado de rPOXA 1B. El RTS fue soportado computacionalmente con estudios de dinámica molecular (MD) a cuatro temperaturas diferentes (-32, 5, 25 y 41°C); [241, 278, 298 y 314 K] muy cercanas a las evaluadas experimentalmente. Otra parte de los concentrados enzimáticos de los lotes L1, L3 y L4 se utilizaron en la remoción de colorantes en aguas residuales coloreadas de laboratorios (CLWW) de prácticas e investigación de la Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, D.C., Colombia. Se realizaron tres procesos (P1, P2 y P3) de remoción, empleando CLWW a 1500 unidades de color (UC), en una Planta Piloto de Tratamiento que consta de un tanque de homogeneización, neutralización y mezcla de 20 L, seguido de un biorreactor de aireación prolongada (flujo turbulento y oxígeno de disolución - 1 mgL-1) de 15 L con 10 L de VET, a temperatura ambiente del laboratorio (~19 ± 3 °C) y con un tiempo de retención hidráulica de 72 h, seguido de dos filtros de arena cuarcítica. Durante el curso de la investigación y de acuerdo a la exigencia de cada metodología, se midió: actividad enzimática (UL-1), concentración de proteínas (mg mL-1), concentración de azúcares reductores (gL-1), actividad específica (Umg-1), biomasa (gL-), velocidad específica de crecimiento µx (h-1), tiempo de duplicación td (h), velocidad máxima de reacción Vmax (mM min-1), constante de Michaelis-Menten KM (mM), productividad (UL-1h-1), carbono total (CT) (mgL-1), nitrógeno total (NT) (mgL-1), relación carbono-nitrógeno C/N, constante de desactivación kd (meses-1), vida media t1/2 (meses), energía de desactivación Ed (kJ mol-1), variación de entalpía H* (kJ mol-1), variación en la energía libre de Gibb´s G* (kJ mol-1), variación de entropía S* (J mol-1K-1), carbono inorgánico (CI) (mgL-1), carbono orgánico total (COT) (mgL-1), demanda química de oxígeno (DQO) (mgL-1), demanda biológica de oxígeno a los 5 días DBO5 (mg L-1), relación COT/NT, relación DQO/COT, pH, unidades de color UC e índice de germinación IG (%). Resultados. El uso de tampón citrato incrementó la afinidad de rPOXA 1B por el sutrato (ABTS) con una KM inferior a la del tampón acetato; las condiciones estandarizadas fueron pH 3.0 ± 0.2; λ420 nm, 2 mM ABTS y los análisis de acoplamiento molecular obtuvo un complejo de unión enzima sustrato con una energía libre de unión de -6.4 KJ mol-1. En biorreactor de 10 L con el medio previamente mejorado se obtuvo 8,506.95 ± 1,993.65 UL-1 con actividad específica de 213.64 ± 55.83 Umg-1 a las 192 h de cultivo, usando tampón citrato. Después de la optimización estadística secuencial se obtuvo un medio (20 gL-1 glucosa USP, 50 g L-1 proteína de soya aislada 90 % (p/p), 11.74 g L-1 extracto de malta, 4.91 gL-1 (NH4)2SO4, 0.16 gL-1 CuSO4 y 0.1 gL-1 cloranfenicol) 89.84 % menos costoso, con una actividad enzimática de 12,877.3 ± 481.2 UL-1 y actividad específica de 1324.58 ± 114.19 U mg-1 en 168 h, lo que significó un incremento en la actividad enzimática del 33.94 % con relación a los resultados en biorreactor de 10 L con medio mejorado. La adición de metanol después del agotamiento de la glucosa tuvo un efecto positivo sobre la actividad enzimática y se obtuvo 14,868.06 ± 461.58 U L-1 con actividad específica de 1597.6 ± 76.28 U mg-1 en 192 h utilizando el medio optimizado de bajo costo, para un incremento de 41 % de la actividad enzimática en comparación con el mismo medio sin adición de metanol. En el RTS se recuperó 101.16, 115.81, 75.23, 46.09, 5.81 y 4.83 % de la actividad enzimática relativa, a las diferentes temperaturas ensayadas. Los estudios de AS mostraron que el concentrado de rPOXA 1B se puede conservar a 240.98  5.38, 277.40  1.32 o 297.53  3.88 K con t1/2 de 230.8, 46.2 y 12.6 meses, respectivamente. Los parámetros cinéticos y termodinámicos respaldaron la alta estabilidad de rPOXA 1B con bajas variaciones de KM y Vmax a temperaturas de 240.98  5.38 y 297.53  3.88 K, Ed de 41.40 KJ mol-1 y valores apropiados de ∆H, ∆G y ∆S. La MD mostró que las fluctuaciones en la estructura 3D de POXA 1B, específicamente en regiones bucle, coils or loops con aminoácidos hidrofílicos o de polaridad intermedia, así como en algunos residuos, se incrementa con el aumento de la temperatura; pasando de 3 residuos fluctuantes (LEU159, ALA391 y ASP429) a 278 K a 6 residuos (THR160, ASP266, GLU293, ALA334, ASP341 y LEU459) a 298 K y a 9 residuos (ASP101, THR160, GLY265, ASN297, ALA334, GLY370, ALA391, PRO393 y ASP433) a 314 K. La remoción de color promedio del CLWW (1500 UC) fue de 96.75 % y se logró la reducción de los parámetros de descarga TOC, TC, DQO y DBO5. Conclusiones. Con el medio optimizado se aumentó la actividad enzimática 33 % con relación al medio previamente mejorado. Se demostró el efecto positivo de añadir CH3OH al cultivo, después del agotamiento de la glucosa, lo que generó un incremento de 41 % en comparación con el medio sin metanol. Es importante destacar que la adición de metanol no es una opción amigable con el medio ambiente, ya que el concentrado enzimático se utiliza impuro y podría contener trazas de metanol, pero resulta de utilidad si se requiere la producción de la enzima pura para usos no ambientales, además, de que rompe con el hábito de utilizar estrictamente glucosa para la expresión de proteínas recombinantes bajo el control del promotor pGAP, como sucede con la mayoría de los trabajos publicados. La lacasa rPOXA 1B es una enzima estable, lo cual fue demostrado experimental y computacionalmente con t1/2 de 230.8, 46.2 ó 12.6 meses, si es conservada impura y sin preservantes a temperaturas de 240.98  5.38, 277.40  1.32 o 297.53  3.88 K respectivamente, lo cual tiene gran utilidad para los grandes productores. El tratamiento secundario de CLWW (1500 UC) con el concentrado de rPOXA 1B generó una remoción de color promedio de 96 % en 72 h de tratamiento con disminución de los parámetros de vertimiento.

Statistical Improvement of rGILCC 1 and rPOXA 1B Laccases Activity Assay Conditions Supported by Molecular Dynamics

“…2.7. Molecular Dynamics of 3D Models of GILCC 1 and POXA 1B the Complexes GILCC 1-ABTS and POXA 1B-ABTS at pH 3.0 Both 3D models of GILCC 1 and POXA 1B [32] exhibited RMSD values of less than 2 Å throughout the trajectory (200 ns) (Supplementary Material Figure S1a). No bond breaks occurred in the active centers of the enzymes.…”

“…Both 3D models of GILCC 1 and POXA 1B [32] exhibited RMSD values of less than 2 Å throughout the trajectory (200 ns) (Supplementary Material Figure S1a). No bond breaks occurred in the active centers of the enzymes.…”

“…Conformational fluctuations are crucial for substrate binding and product release; however, they may limit the rate of enzymatic reactions, as higher fluctuation of active site residues may favor higher enzymatic activity [81]. However, other authors mentioned that rigidity may also be associated with interactions generated by the surrounding residues [82], so flexible regions may be due to the loss of interactions or bonds that maintain the rigidity of the structure [32,83]. In both enzymes evaluated, the interaction with the ligand (ABTS) generated behavioral changes, as has been observed by other authors [84].…”

“…The 3D structure of the laccase was predicted and analyzed following the methodology utilized by Ardila-Leal et al (2021) and generated using the Swiss-model server. All coppers (Cu T1 and Cu from TNC) were modelled as Cu 2+ in the GILCC 1 binding pocket using the metal center parameter builder based in Python (MCPB.py) [32,83], which consists of employing two models to achieve a balance between precision and speed, thus obtaining parameters of bonds, angles, and partial charges of the metal ions and the residues of the active center [88], included in the Amber tools 18 package [89]. The molecule's partial charges resulted from the electrostatic calculation using Gaussian calculations [90].…”

“…The generated 3D model of the GILCC 1 enzyme used in this study was validated and parameterized at pH 3.0 following the same methodology employed for the POXA 1B model [32].…”