Production and Purification of Recombinant Proteins

Luitjens, Alfred; Corven, Emile van

doi:10.1007/978-3-030-00710-2_4

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“…Suas principais características estão descritas na Tabela abaixo. Amann et al 2018;Burnett;Burnett, 2020; A escolha do melhor sistema depende de vários fatores, a começar pelo tamanho e complexidade da proteína de interesse, custo e complexidade do processo, enovelamento e solubilidade da proteína, taxa de crescimento celular e produtividade e aspectos de segurança (AMANN et al, 2019;BURNETT;BURNETT, 2020;LUITJENS, CORVEN, 2019). Os sistemas de expressão baseados em microrganismos, principalmente bactérias, dominaram o início da produção de proteínas recombinantes até o fim dos anos 90, principalmente devido à grande capacidade de crescimento dessas células, baixo custo dos meios de cultura e dos processos de cultivo, além da alta produtividade (DINGERMANN, 2007, WURM, 2002.…”

Section: Sistemas De Expressão Para Proteínas Recombinantes Terapêuticasunclassified

Produção do fator VII da coagulação sanguínea recombinante em células humanas

Heluy¹

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A maioria das proteínas terapêuticas recombinantes complexas são produzidas em células de mamíferos, principalmente células CHO. Apesar de apresentarem uma capacidade de expressar proteínas com modificações pós-traducionais (MPTs) similares à humana, essas células podem expressar padrões de glicosilação que são imunogênicos para seres humanos. Nesse sentido, as linhagens celulares humanas surgem como um sistema de expressão promissor, principalmente pela capacidade de produzir proteínas com glicosilação mais próxima ao organismo humano. Este trabalho tem como objetivo analisar a capacidade de quatro linhagens celulares humanas para produção de fator VII recombinante da coagulação sanguínea humana (FVIIr), proteína terapêutica utilizada no tratamento de pacientes hemofílicos que desenvolveram inibidores contra o fator IX (FIX) ou fator VIII (FVIII) da coagulação, em suspensão em meios livres de soro fetal (SFB). As linhagens celulares humanas SK-Hep-1, HKB-11, HEK293SF e Huh-7 foram cultivadas em erlenmeyers (150 rpm, 5% de CO2, 37°C) para comparação do potencial de expressão de FVIIr e atividade biológica dessa proteína. Foi possível observar no sobrenadante de 48h, por meio de ELISA, uma concentração de 148,5 ng/mL, 172,5 ng/mL, 72,3 ng/mL e 32 ng/mL, respectivamente, para as células SK-Hep-1, HKB-11, Huh-7. A atividade biológica foi conferida por meio de TP, onde foram obtidos valores de 3,6 UI/mL, 3,15 UI/mL, 0,72 UI/mL e 0 UI/mL para as células SK-Hep-1, HKB-11, Huh-7 e HEK293SF, respectivamente. A célula HKB-11 foi escolhida para a etapa seguinte do trabalho, que envolveu a suplementação com vitamina K em duas diferentes concentrações, 1,0 e 2,5 µg/mL, visando o aumento tanto da expressão quanto da atividade biológica do FVIIr. Foi possível observar que o aumento da concentração de vitamina K no meio de cultura não influenciou o crescimento e metabolismo celular de maneira significativa quando comparados ao controle (sem vitamina), entretanto, os resultados obtidos para expressão e atividade biológica foram superiores para a célula cultivada em 1,0 µg/mL em relação àquela cultivada em 2,5 µg/mL. Um delineamento experimental do tipo Box-Behnken, com quatro fatores (ácido cítrico, butirato de sódio (NaBu), glutationa reduzida (GSH) e temperatura de cultivo) e 27 ensaios foi executado em tubos minibiorreator (180 rpm, 5% de CO2, 37°C) tendo como objetivo o aumento da expressão de FVIIr e da produtividade específica (qFVIIr). Dois modelos matemáticos significativos foram obtidos com o delineamento experimental e a partir da função desejabilidade, foi possível determinar os valores de 2 mM de NaBu, 2,5 mM de GSH e 34°C como condições ótimas para obtenção de 1 µg/mL de FVIIr e produtividade específica de 7 ng/10 6 células/h, valores bastantes significantes quando comparados a diversos trabalhos presentes na literatura.

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Section: Sistemas De Expressão Para Proteínas Recombinantes Terapêuticasunclassified

Produção do fator VII da coagulação sanguínea recombinante em células humanas

Heluy¹

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“…Las purificación de manera específica para proteínas y péptidos, se realiza mediante columnas cromatográficas, la operación consiste en hacer fluir una mezcla de compuestos proteicos y sus contaminantes por una columna rellena de un material sólido y poroso (fase estacionaria) inmerso en un solvente (fase móvil), y en dependencia de la relativa afinidad de los componentes de la mezcla por ambas fases, ocurre o no, la separación de dichos componentes de manera individual [147]. Se puede decir que la cromatografía es un proceso de separación que se basa de forma general en la acumulación o deposición de un soluto en una superficie.…”

Section: Purificación De Péptidos Recombinantes (Etapa 3)unclassified

“…En la Figura 17 se muestran los factores o pasos que influyen directamente en el fenómeno de transferencia de masa desde la fase líquida al interior de la partícula que compone la fase estacionaria, en el caso específico de la CEM el paso 4 no es considerado como determinante en el proceso de separación, debido a que en este tipo de operación cromatográfica la separación de un soluto no es regida por la unión a la fase estacionaria, ya que esta se basa exclusivamente en la separación por tamaños y formas moleculares mediante la difusión intraparticular, de manera específica la CEM se basa fundamentalmente, en la separación de moléculas en la difusión a través de los macroporos [49,147,149,162].…”

Section: Figura 17 Factores Del Transporte De Materia En La Cromatogr...unclassified

Desarrollo y producción recombinante de un péptido bloqueador de TNF para el tratamiento de trastornos autoinmunes inflamatorios.

Sánchez Ramos,

Zaror Zaror

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El Factor de Necrosis Tumoral (TNF; de sus siglas en inglés, tumor necrosis factor), se ha transformado en una importante diana terapéutica para el tratamiento de trastornos autoinmunes inflamatorios. A la fecha, existen 5 biofármacos bloqueadores de TNF aprobados por la FDA que corresponden a proteínas de fusión y anticuerpos monoclonales. A pesar de los resultados terapéuticos informados, estos biofármacos poseen desventajas que limitan su uso, entre ellas: (i) deben ser producidos en cultivos de células de mamíferos, a un elevado costo de producción, (ii) son moléculas considerablemente grandes (~150 kDa), lo que limita la penetración de tejidos y condiciona el uso de altas dosis, (iii) tienen altos precios de mercado (~100 000 dólares/año, para una terapia individual), lo que implica que menos del 10% de los pacientes tenga acceso a este tipo de terapia. Para solucionar estas limitaciones, el Laboratorio de Biofármacos Recombinantes (LBR), de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad de Concepción, empleando la tecnología de Phage Display, ha desarrollado un péptido de unión a TNF (CBB288) con capacidad bloqueadora. Los péptidos, como potenciales bioactivos, suelen ser selectivos, poco tóxicos, y con un tamaño molecular (≤5 kDa) que permite el uso a bajas dosis respecto a los anticuerpos monoclonales. Como limitante, es conocido que existe una escasa optimización de operaciones a escala industrial para sintetizar péptidos, resultando la síntesis química de péptidos en un proceso caro y poco sustentable que genera un exceso de residuos tóxicos. En este marco, el avance de la biotecnología ofrece variantes con buena combinación de costo-sustentabilidad, donde sobresale la expresión de proteínas en Escherichia coli. En este trabajo, tres etapas fundamentales fueron establecidas para producir el r-CBB288, en una primera etapa de fermentación se expresaron copias repetidas del CBB288 en forma de tándem, luego, para obtener el péptido recombinante se realizó una proteólisis asistida con hidroxilamina (HX) y posteriormente para purificar el péptido se utilizó una cromatografía de exclusión molecular (CEM). Las tres operaciones se evaluaron mediante diseño experimental para analizar la influencia de los principales parámetros operacionales sobre las variables respuestas más importantes. En el caso de la CEM, resulta válido aclarar que las operaciones de purificación en los procesos biotecnológicos constituyen alrededor del 70% del costo total de producción, motivo por el cual estas operaciones deben ser optimizadas con rigor, para evitar afectaciones en la factibilidad del proceso. En este sentido, para la CEM se desarrolló un modelo fenomenológico que permite describir la operación e inferir el comportamiento a dimensiones requeridas. Para demostrar que el r-CBB288 conserva la capacidad unirse al TNF, ensayos de Termoforesis en Microescala (TMS) determinaron las constantes de disociación (Kd) respecto a la diana molecular. Además, ensayos MTT se llevaron a cabo para demostrar el bloqueo de la actividad citotóxica del TNF. Por otra parte, se demostró que la alternativa del péptido sintético no presenta diferencias respecto a su homólogo recombinante en cuanto a afinidad, para esto se realizó un estudio de simulación in silico desarrollado mediante dinámica molecular. Finalmente, un análisis técnico-económico del proceso se ejecutó mediante la herramienta de simulación computacional SuperPro Designer. Los resultados obtenidos sugieren que el péptido diseñado previamente CBB288 puede ser obtenido a partir de un proceso recombinante y utilizado en futuros estudios biomédicos relacionados con las patologías de inflamación crónicas.

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Production and Purification of Recombinant Proteins

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Produção do fator VII da coagulação sanguínea recombinante em células humanas

Produção do fator VII da coagulação sanguínea recombinante em células humanas

Desarrollo y producción recombinante de un péptido bloqueador de TNF para el tratamiento de trastornos autoinmunes inflamatorios.

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