Production and Uptake of Distinct Endogenous Catecholate-Type Siderophores Are Required for Iron Acquisition and Virulence in Chromobacterium violaceum

Abstract

Bacteria use siderophores to scavenge iron from environmental or host sources. The iron acquisition systems of Chromobacterium violaceum, a ubiquitous environmental bacterium that can cause infections in humans, are still unknown. In this work, we demonstrated that C. violaceum produces putative distinct endogenous siderophores, here named chromobactin and viobactin, and showed that they are each required for iron uptake and virulence. An in silico analysis in the genome of C. violaceum revealed that genes related to synthesis and uptake of chromobactin (cba) and viobactin (vba) are located within two secondary-metabolite biosynthetic gene clusters. Using a combination of gene deletions and siderophore detection assays, we revealed that chromobactin and viobactin are catecholate siderophores synthesized from the common precursor 2,3-dihydroxybenzoate (2,3-DHB) on two nonribosomal peptide synthetase (NRPS) enzymes (CbaF and VbaF) and taken up by two TonB-dependent receptors (CbuA and VbuA). Infection assays in mice revealed that both the synthesis and the uptake of chromobactin or viobactin are required for the virulence of C. violaceum, since only the mutant strains that do not produce any siderophores or are unable to take up both of them were attenuated for virulence. In addition, the mutant strain unable to take up both siderophores showed a pronounced attenuation of virulence in vivo and reduced neutrophil extracellular trap (NET) formation in in vitro assays, suggesting that extracellularly accumulated siderophores modulate the host immune response. Overall, our results revealed that C. violaceum uses distinct endogenous siderophores for iron uptake and its establishment in the host.

Interplay between two quorum sensing‐regulated pathways, violacein biosynthesis and VacJ/Yrb, dictates outer membrane vesicle biogenesis in Chromobacterium violaceum

“…To access growth phase‐dependent expression of these operons, the strains were grown until exponential phase (OD 600 ~ 1) and stationary phase (OD 600 ~ 5). To achieve iron limitation conditions, C. violaceum cultures in exponential phase were exposed to the iron chelator 2,2′‐dipyridyl for 1 h, as previously described (Batista et al ., 2019). The β‐galactosidase activity was assayed using o ‐nitrophenyl‐β‐ d ‐galactoside (ONPG) as a substrate, and measuring absorbance at 420 nm (Miller, 1972).…”

Mecanismos de captação de heme em Chromobacterium violaceum

“…Este papel fundamental da resposta imune inata (macrófagos e neutrófilos) em conter a infecção por C. violaceum visto em camundongos parece ser um bom modelo para o que ocorre na infecção em humanos, inclusive com a preferência da bactéria em infectar hepatócitos (MIKI et al, 2010;MALTEZ et al, 2015). A importância da captação de ferro por sideróforos na patogênese de C. violaceum já foi demonstrada (BATISTA et al, 2019), mas nada se sabe sobre o papel do heme na fisiologia e patogênese desta bactéria. Componentes estruturais do T3SS ativam inflamassoma do tipo NLRC4, induzindo a ativação da caspase-1 e piroptose do macrófago.…”

“…A concentração inibitória mínima de dipiridil (DP) para a linhagem selvagem foi anteriormente determinada em meio LB (BATISTA et al, 2019), mas não em meio mínimo M9HC. Para isto, pré-inóculos em M9HC foram diluídos para DO600 0,01 em M9HC com concentrações de DP variando de 100 µM a 175 µM.…”

“…A análise da atividade de sideróforos nas diferentes linhagens foi realizada utilizando o ensaio Cromo Azurol S (ensaio de CAS) (BATISTA et al, 2019). Neste ensaio, a detecção da presença de sideróforos é feita pela alteração da cor do meio.…”

“…Para isto, o quelante de alta afinidade a ferro DP foi utilizado em diferentes concentrações para obter sua concentração inibitória mínima através da inibição do crescimento bacteriano. A inibição do crescimento de C. violaceum em LB já foi previamente descrita, sendo observada a partir de 300 µM de DP (BATISTA et al, 2019). Já em M9HC, o crescimento bacteriano não ocorreu em concentrações a partir de 132,5 µM de DP (Figura 8).…”