As enzimas representam compostos bioativos que regulam diversas alterações químicas nos tecidos vivos. Sua aplicação torna-se cada vez mais popular devido à sua capacidade de atender a diversas necessidades humanas, sendo amplamente empregadas em diversos setores industriais. As pectinases despontam como uma das enzimas mais produzidas comercialmente, devido às suas múltiplas aplicações em diversos setores industriais, como alimentício, têxtil e de biocombustíveis, representando aproximadamente 25 % das vendas totais de enzimas no mercado. Dessa maneira, este estudo teve como objetivo principal otimizar a produção de pectinase pelo fungo mesofílico PA3S20MB de Mata Atlântica e identificar as condições ideais para a dosagem enzimática, considerando os parâmetros de temperatura, tempo e pH, com a finalidade de explorar suas potenciais aplicações biotecnológicas. Os resultados foram avaliados através da dosagem de atividade enzimática e determinação de proteínas. A maior indução de pectinases pelo fungo PAS20MB ocorreu em cultivo com o meio Khanna, em condições estacionárias, durante 144 h a 28 °C, suplementado com 1 % de casca de maçã. Em relação ao efeito da temperatura, pH e tempo sobre a reação foram encontrados os maiores valores de atividade a 60 °C, pH 5 e em 5 min, respectivamente. No experimento com carvão ativado verificou-se que a concentração de 25 mg/mL foi a mais promissora para o clareamento do extrato enzimático bruto, pois manteve estável a atividade de pectinases e reduziu 80 % da concentração de proteínas. A partir dos resultados foi possível determinar as condições ótimas para produção de pectinases, assim como verificar as de dosagem enzimática e observar que o carvão ativado pode ser um método considerável em uma etapa de purificação.