Protein Engineering for Enhanced Acyltransferase Activity, Substrate Scope, and Selectivity of the Mycobacterium smegmatis Acyltransferase MsAcT

Abstract

The highly efficient and versatile acyltransferase MsAcT from Mycobacterium smegmatis catalyzes aqueous acyl transfer reactions, enabling applications in environmentally friendly processes and enzyme cascades. We rationally designed several variants with up to 30-fold increased acyl transfer to hydrolysis ratios while mostly retaining initial activity. Variants exhibiting broader acyl-donor substrate scope and higher or inverted enantioselectivity were also designed. Alterations of the catalytic His-Asp pair decreased the activation of hydrolytic water, thereby increasing acyl transfer to hydrolysis ratios. This study demonstrates that targeting the disruption of water networks and manipulating the activation of nucleophiles are promising strategies for engineering promiscuous acyltransferase activities.

Across the Board: Pablo Domínguez de María on the Biocatalytic Synthesis of Esters and Amides in Aqueous Media

“…In that respect, variants with 30‐fold improved AT/H ratio (keeping the original enzymatic activity) have been reported [16b] . Likewise, other variants have shown an extended substrate scope (e. g., accepting acyl donors larger than acetate or butyrate), which can definitely broaden the range of future reactions [16b] . Notably, variants that harbor single and double mutations have been specially developed for asymmetric synthesis, given the fact that MsAcT wild‐type displays, in general, a modest stereoselectivity [10,16] .…”

“…An important aspect is to enhance the acyl transfer to hydrolysis ratio (AT/H) to diminish unwanted hydrolytic reactions, which are inevitably observed when an excess of ester accumulates. In that respect, variants with 30‐fold improved AT/H ratio (keeping the original enzymatic activity) have been reported [16b] . Likewise, other variants have shown an extended substrate scope (e. g., accepting acyl donors larger than acetate or butyrate), which can definitely broaden the range of future reactions [16b] .…”

Entdeckung und Design promiskuitiver Acyltransferase‐Aktivität in Carboxylesterasen der Familie VIII

“…Abgesehen von zwei Ausnahmen zeigten alle untersuchten Carboxylesterasen in Gegenwart von Benzylalkohol signifikant hçhere relative Aktivitäten als MsAcT und die zuvor charakterisierten bHSLs. [6,8] EstCE1 katalysiert den Acetyltransfer zu Benzylalkohol 66-mal schneller als die Hydrolyse des Acyldonors und übertrifft damit sogar eine der effizientesten MsAcT-Varianten (K97A; 50-mal schneller), über die unsere Gruppe kürzlich berichtete. [6] Bemerkenswert ist, dass EstM2 [15] die Acetylierung von Benzylalkohol sogar 149-mal schneller katalysiert als die Donor-Hydrolyse und damit etwa 20-mal effizienter als MsAcT ist.…”

“…Umfangreiches Protein-Engineering war im Falle von MsAcT notwendig, um das Substratspektrum für C8-Ketten zu erweitern, wobei selbst die beste Variante (F154A/I194V) ein AT/H-Verhältnis von unter 3 aufweist. [6] 3ZYT zeigt zwar keine Transacetylase-Aktivität, dafür aber moderate Acyltransferase-Aktivität in Reaktionen mit Acyldonoren zunehmender Kettenlängen (Tabelle S3). Dies kann durch die hydrophoben aliphatischen Ketten erklärt werden, die Wasser aus der Bindungstasche ausschließen und dadurch die Hydrolyse erschweren sowie die Bindung organischer Akzeptoren begünstigen.…”

“…Durch Mutation von HDG in 3ZYT zu HGG oder WGG (Abbildung 3 C) konnte eine "Hydrolase" rational in eine "Acyltransferase" überführt werden, die mit MsAcT, dem aktuellen Maßstab für promiskuitive Acyltransferase-Aktivität, vergleichbar ist. [5,6] Um die Rolle dieses Motivs sowohl für die Hydrolase als auch für die Acyltransferase-Aktivitäten besser verstehen zu kçnnen, wurden darüber hinaus mehrere EstCE1-Varianten konstruiert und mittels pNPA-AcT-Assay charakterisiert transferasen zu identifizieren und das allgemeine Verständnis von promiskuitiver Acyltransferase-Aktivität zu vertiefen. Wir konnten zeigen, dass viele Carboxylesterasen der Familie VIII die Grenzen dessen, was bisher für mçglich gehalten wurde, überschreiten, indem sie die Bildung von Estern, Carbonaten, Carbamaten und Amiden, wie dem Antidepressivum Moclobemid, mit beispielloser Effizienz katalysieren.…”