PURIFICAÇÃO DE FRAGMENTOS Fab POR IMAC EM AGAROSE-CM-Asp-Co(II)

Abstract

RESUMO -As imunoglobulinas G (IgG) e seus fragmentos Fab, F(ab)' 2 e Fv apresentam aplicações relevantes na área médica e de diagnóstico. O elevado custo de purificação dessas biomoléculas por técnicas de afinidade justifica a investigação de alternativas de baixo custo para a sua purificação. O objetivo deste trabalho é avaliar a eficácia do quelato CM-Asp-Co(II) imobilizado em agarose na purificação dos fragmentos Fab de IgG humana, a partir de uma solução de IgG clivada pela enzima papaína. O efeito do sistema tamponante e do cloreto de sódio foram avaliados. O tampão Hepes na ausência de sal, permitiu obter os fragmentos Fab com pureza superior a 90%. Esse tampão possibilitou a maior recuperação seletiva dos fragmentos, em comparação com o tampão Hepes contendo NaCl e com os tampões, Tris-HCl e fosfato de sódio. Os resultados evidenciaram a potencialidade desse ligante para purificação de fragmentos Fab. INTRODUÇÃOOs fragmentos Fab, F(ab)' 2 e Fv obtidos da clivagem da IgG ou por meio da tecnologia do DNA recombinante, são proteínas que apresentam aplicações relevantes em terapias e diagnósticos. Tais biomoléculas são caracterizadas por possuírem massa molar e tempo de meia-vida inferiores ao da IgG intacta, consequentemente apresentam maior facilidade de penetração nos tecidos alvo e menor tempo de depuração plasmática (Chames et al., 2009). Nos últimos anos, vários fragmentos de IgG foram aprovados pelo FDA (Food and DrugAdministration) e têm sido empregados em diagnósticos por imagem in vivo, nas terapias de doenças degenerativas e cânceres (Hansel et al., 2010). A aplicação dos fragmentos de anticorpos nesses segmentos representa, aproximadamente, 6 bilhões de dólares por ano (Holliger e Hudson, 2005).Para serem empregados nessas aplicações é requerido um elevado grau de pureza da IgG e de seus fragmentos. Tradicionalmente, a purificação dessas biomoléculas é realizada por meio da técnica de cromatografia de afinidade, empregando como ligantes a proteína A ou a proteína G imobilizadas (Huse et al., 2002). No entanto, esses ligantes apresentam algumas desvantagens, tais como o elevado custo, o risco de desnaturação do anticorpo e de desprendimento do ligante da matriz em decorrência das condições de eluição a baixos valores de pH e o risco da inativação do ligante após sucessivos ciclos de purificação (Ayyar et al., 2012). Diante desses inconvenientes, estudos têm sido desenvolvidos visando o emprego de técnicas alternativas à cromatografia de afinidade (Coleman e Mahler, 2003; Yu e Ghosh, 2010) ou de ligantes substitutos das proteínas A e G (Khoury e Lowe, Área temática: Processos Biotecnológicos 1