Purificación, clonación y expresión de inhibidores peptídicos de proteasas de potencial aplicación biomédica a partir de <i>Solanum tuberosum</i> spp.

Abstract

Los inhibidores de proteasas de naturaleza proteica son importantes moléculas reguladoras que inhiben la acción de enzimas proteolíticas y se encuentran extensamente distribuidos en diferentes tejidos de animales, plantas y microorganismos. En su gran mayoría, los inhibidores de proteasas presentes en la naturaleza son proteicos, con la excepción de pequeños inhibidores de microorganismos. Estas moléculas han demostrado su acción en el tratamiento de diferentes patologías en las cuales la desregulación en la acción de las proteasas puede conducir a desequilibrios fisiológicos que llevan a la muerte celular. El presente trabajo de tesis doctoral tiene como objetivo el estudio de nuevas miniproteínas inhibidoras de carboxipeptidasas de tipo “cystine knot” a partir de extractos de tubérculos de Solanum tuberosum grupo andígenum variedada Churqueña. Para este propósito se aplicaron una diversidad de técnicas tales como la espectrometría de masas, biología molecular, expresión recombinante de proteínas, ensayos enzimáticos y caracterización del plegamiento oxidativo. Dentro de estas técnicas, la espectrometría de masas ha sido de gran importancia en este trabajo la cual fue de utilidad en la identificación, caracterización y validación de las moléculas estudiadas. El trabajo se encuentra dividido en tres capítulos a través de los cuales se presentan los resultados obtenidos. En el primer capítulo se describe el estudio y caracterización de un extracto crudo de tubérculos de papa andina determinando su actividad inhibitoria frente a proteasas de diferente tipo mecanístico. Se estudió la estabilidad térmica de los inhibidores de carboxipeptidasas presentes en el extracto y se determinaron los pesos moleculares de las proteínas resistentes a este tratamiento térmico mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Además, se utilizó una técnica proteómica, denominada Intensity Fading MALDI-TOF, mediante la cual se verificó la interacción de moléculas presentes en el extracto con carboxipeptidasa A. Por último, se purificó una molécula que produce inhibición de carboxipeptidasa A mediante cromatografía de afinidad y se realizó un análisis de la huella peptídica o PMF (Peptide Mass Fingerprinting) para su identificación de su secuencia primaria en bases de datos. En el segundo capítulo se presenta el estudio de dos miniproteínas con potencial actividad inhibitoria de carboxipeptidasas. Para llevarlo a cabo, ambas proteínas se expresaron de forma recombinante, se determinó su actividad inhibitoria y se realizaron estudios de plegamiento oxidativo. Además se presentan en este capítulo, modelos estructurales de una de las miniproteínas expresadas utilizando herramientas bioinformáticas. En el tercer capítulo, se aisló desde un brote de tubérculo de Churqueña el ARNm de un tercer inhibidor de carboxipeptidasa. En este capítulo, se muestran los resultados de la expresión recombinante y purificación de este inhibidor, y se presenta su actividad inhibitoria frente a carboxipeptidasas A y B. Asimismo, se describe la identificación de la proteína nativa en el extracto de papa mediante técnicas proteómicas como PMF-MALDI-TOF MS y secuenciación de novo PMF-MALDI-TOF-TOF/MS/MS.