Purification and characterization of a protease-resistant phytase of Aspergillus oryzae SBS50 whose properties make it exceptionally useful as a feed supplement

Sapna, .; Singh, Bijender

doi:10.1016/j.ijbiomac.2017.05.077

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“…Aspergillus spp., especially A. oryzae , are the microorganisms predominantly utilized during the fermentation process of broad beans (Vishwanatha et al 2009 ). They produce a diverse array of enzymes, such as protease (Murthy and Kusumoto 2015 ), amylase (Zhang et al 2017 ), phytase (Sapna and Singh 2017 ) and cellulase (Takashima et al 1998 ). Among these, the neutral protease is the most important and widely used enzyme.…”

Section: Introductionmentioning

confidence: 99%

Purification and characterization of neutral protease from Aspergillus oryzae Y1 isolated from naturally fermented broad beans

et al. 2018

AMB Expr

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The strain Y1, with a notably high production of neutral protease, was isolated from naturally fermented broad beans and subsequently identified as Aspergillus oryzae, through the analysis of its morphology characteristics and 18S rDNA sequence. Naturally fermented broad beans are the main raw material in Sichuan broad-bean sauce. The neutral protease from Aspergillus oryzae Y1 was purified using ammonium sulphate precipitation and DEAE-Sepharose Fast Flow chromatography, which resulted in a 10.0-fold increase in the specific activity (2264.3 U/mg) and a recovery rate of 21%. The estimated molecular mass of the purified protease was approximately 45 kDa. The optimal pH and temperature of the purified protease were 7.0 and 55 °C, respectively. The heat resistance of the purified protease was significantly higher than the commercial protease. The effect of metal ions on the activity of the purified protease approximated that of commercial neutral protease. Furthermore, the maximum hydrolysis rate (Vmax) and apparent Michaelis–Menten constant (Km) values of the purified protease were 256.4103 μg/mL min and 20.0769 mg/mL, respectively. The purified protease had a higher affinity for the substrate than the commercial neutral protease. All the results suggest that this neutral protease exhibits the potential for application in industry due to its good resistance to high temperatures and wide range of acids and bases.

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Section: Introductionmentioning

confidence: 99%

Purification and characterization of neutral protease from Aspergillus oryzae Y1 isolated from naturally fermented broad beans

et al. 2018

AMB Expr

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“…Phytase was assayed by determining the amount of inorganic phosphorus released using calcium phytate (Sapna and Singh 2013, 2015, 2017. The amount of free phosphate released was determined according to Fiske and Subbarow (1925).…”

Section: Analytical Procedures and Enzyme Assaysmentioning

confidence: 99%

Engineering fungal morphology for enhanced production of hydrolytic enzymes by Aspergillus oryzae SBS50 using microparticles

Singh

2018

3 Biotech

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Effect of microparticles and silver nanoparticles was studied on the production of hydrolytic enzymes by a potent phytase-producing mould, SBS50. Addition of microparticles, viz. talc powder and aluminum oxide enhanced phytase production from 2894 to 3903 and 2847 to 4204 U/L, cellulase from 2529 to 4931 and 2455 to 3444 U/L, xylanase from 9067 to 9642 and 9994 to 14,783 U/L, amylase from 5880 to 11,000 and 6130 to 13,145 U/L, respectively. Fungal morphology was also engineered by the use of microparticles. Fungal pellet size was significantly reduced (~ 90%) by the addition of microparticles. Fermentation time was reduced from 4 to 3 days after the addition of microparticles, thus increasing the productivity of the enzymes significantly. These results confirmed the importance of microparticles in engineering fungal morphology for enhanced production of hydrolytic enzymes.

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“…Dessa forma, fica claro que grande parte das fitases descritas até o momento são fortemente inibidas por ferro, zinco e cobre. No entanto, não se sabe se esse efeito inibitório é resultado da formação de um complexo insolúvel resultante da ligação do fitato com esses íons metálicos e consequente, redução na concentração do ácido fítico disponível para a enzima, ou se resulta da ligação desses íons diretamente com a enzima (SINGH;SATYANARAYNA, 2009;MONTEIRO, 2011;TAN et al, 2016;HALLAJI et al, 2019 (FUNGTHONG et al, 2010;MONTEIRO et al, 2015;TAN et al, 2016;SAPNA et al, 2017, AJITH et al, 2019VILLAMIZAR et al, 2019a) SATYANARAYAMA, 2009;MONTEIRO et al, 2015, VILLAMIZAR et al, 2019a FUGTHONG et al, 2010;VILLAMIZAR et al, 2019a). No entanto, Monteiro et al (2015) SATO, 2015;SAPNA et al, 2017).…”

Section: Mg 2+unclassified

“…No entanto, essa única característica não é suficiente para caracterizar uma fitase. (ZHANG et al, 2010;MONTEIRO et al, 2015;VILLAMIZAR et al, 2019b A atividade específica da MtPhy (954,8 U/mg) foi bastante superior a de várias outras fitases descritas na literatura, de diferentes fungos, cujas atividades específicas variaram de 10,3 a 303,7 U/mg (WYSS et al, 1999;AZEKE et al, 2011;GUNASHREE;VENKATESWARAN, 2015;SAPNA;SINGH, 2017;TANG et al, 2018;SANNI et al, 2019). Isso demonstra grande afinidade da enzima MtPhy ao substrato fitato de sódio.…”

Section: Mg 2+unclassified

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Clonagem, expressão e caracterização de fitase do fungo termofílico >i<Myceliophthora thermophila>/i<

Ferreira¹

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Fitases são enzimas que hidrolisam o ácido fítico, substâncias orgânicas complexas amplamente encontradas na natureza, principalmente em cereais e leguminosas. Nesses alimentos vegetais, o fitato é a principal fonte de fósforo, correspondendo entre cinquenta a oitenta por cento do conteúdo de fósforo orgânico. Entretanto, o fósforo do fitato é muito pouco utilizado por humanos e outros animais monogástricos, como suínos e aves, devido à ausência ou insuficiência das enzimas que o degradam. Assim, rações contêm o fósforo orgânico do fitato e fósforo inorgânico adicionado, que é um mineral caro e não renovável. Em áreas de criação intensiva o excesso de fósforo é excretado no ambiente, causando problemas, tais como a eutrofização. Devido aos problemas ambientais e ao alto custo do fósforo inorgânico, a suplementação de enzimas, principalmente fitases, tem ganhado destaque, entre elas, as enzimas fúngicas, devido a sua estabilidade a diferentes temperaturas e pH. Além disso, técnicas de engenharia genética permitem a transferência de genes entre espécies, resultando em muitos benefícios, principalmente em relação ao aumento e melhoramento na produção de enzimas industriais. O objetivo deste trabalho foi realizar a clonagem, expressão heteróloga, purificação e caracterização bioquímica da enzima fitase (MtPhy) obtida a partir do fungo termofílico M. thermophila. O gene que codifica a enzima foi clonado no vetor pEXPYR e heterologamente expresso em A. nidulans. A proteína recombinante foi purificada e teve sua identidade confirmada por espectrometria de massas. Nas análises bioquímicas, apresentou pH ótimo de 5,0 e temperatura ótima de 60°C e manteve praticamente 100% de sua atividade a 50°C por 2 horas e pela análise de dicroísmo circular e ThermoFluor, apresentou desenovelamento de sua estrutura nas temperaturas de 63 e 67°C, respectivamente. Demonstrou atividade aumentada na presença de CaCl 2 e MgCl 2 e foi fortemente inibida por FeCl 3 , CuSO 3 e SDS. Sua atividade específica (954,8 U/mg) utilizando fitato de sódio foi bastante superior a de outras fitases descritas na literatura. Demonstrou-se efetiva na liberação do fósforo em rações e extremamente resistente às proteases, tripsina e pepsina, presentes no trato digestório de animais monogástricos, demonstrando dessa forma, seu elevado potencial para aplicação industrial. Palavras-chave: Fitases. Fungos termofílicos. Myceliophtora thermophila.

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Purification and characterization of a protease-resistant phytase of Aspergillus oryzae SBS50 whose properties make it exceptionally useful as a feed supplement

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Purification and characterization of neutral protease from Aspergillus oryzae Y1 isolated from naturally fermented broad beans

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Engineering fungal morphology for enhanced production of hydrolytic enzymes by Aspergillus oryzae SBS50 using microparticles

Clonagem, expressão e caracterização de fitase do fungo termofílico >i<Myceliophthora thermophila>/i<

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