Purine Nucleoside Phosphorylase. 2. Catalytic Mechanism

Abstract

X-ray crystallography, molecular modeling, and site-directed mutagenesis were used to delineate the catalytic mechanism of purine nucleoside phosphorylase (PNP). PNP catalyzes the reversible phosphorolysis of purine nucleosides to the corresponding purine base and ribose 1-phosphate using a substrate-assisted catalytic mechanism. The proposed transition state (TS) features an oxocarbenium ion that is stabilized by the cosubstrate phosphate dianion which itself functions as part of a catalytic triad (Glu89-His86-PO4=). Participation of phosphate in the TS accounts for the poor hydrolytic activity of PNP and is likely to be the mechanistic feature that differentiates phosphorylases from glycosidases. The proposed PNP TS also entails a hydrogen bond between N7 and a highly conserved Asn. Hydrogen bond donation to N7 in the TS stabilizes the negative charge that accumulates on the purine ring during glycosidic bond cleavage. Kinetic studies using N7-modified analogs provided additional support for the hydrogen bond. Crystallographic studies of 13 human PNP-ligand complexes indicated that PNP uses a ligand-induced conformational change to position Asn243 and other key residues in the active site for catalysis. These studies also indicated that purine nucleosides bind to PNP with a nonstandard glycosidic torsion angle (+anticlinal) and an uncommon sugar pucker (C4'-endo). Single point energy calculations predicted the binding conformation to enhance phosphorolysis through ligand strain. Structural data also suggested that purine binding precedes ribose 1-phosphate binding in the synthetic direction whereas the order of substrate binding was less clear for phosphorolysis. Conservation of the catalytically important residues across nucleoside phosphorylases with specificity for 6-oxopurine nucleosides provided further support for the proposed catalytic mechanism.

Structural Basis for Substrate Specificity of Escherichia coli Purine Nucleoside Phosphorylase

“…Trimeric PNPs usually have a molecular mass of about 100 kDa. The structures of several trimeric PNPs have been determined (1)(2)(3)(4), and the catalytic mechanism has been well studied; the cleavage reaction is believed to proceed through an S N 1 mechanism with an oxocarbenium nucleoside intermediate (5)(6)(7), with ordered substrate binding, and with product release as the ratelimiting step (8,9). Hexameric PNPs are found only in lower organisms and have broader substrate specificity, accepting both 6-amino and 6-oxopurine nucleosides.…”

Purine nucleoside phosphorylase

“…В живых организмах (in vivo), фосфоролиз -доминирующая реакция, благодаря сопряжению с другими ферментами. По-видимому, этим и обьясняется тот факт, что большая часть кинетических данных относится к фосфоролитическим реакциям [75].…”

“…В живых организмах (in vivo), фосфоролиз -доминирующая реакция, благодаря сопряжению с другими ферментами. По-видимому, этим и обьясняется тот факт, что большая часть кинетических данных относится к фосфоролитическим реакциям [75].Имеющиеся литературные данные не дают основание для однозначной трактовки механизма реакции трансрибозилирования (реакция 2). Кинетические исследования, а также применение метода 31 P-ЯМP показали отсутствие промежуточной фосфорилированной и рибозилированной форм фермента, что означает, что реакция 2 протекает в два этапа с образованием промежуточного соединения (d)Rib-1-P за счёт существующих примесей неорганического фосфата.…”

“…Арсенолиз ведет к формированию химически нестабильного соединения рибозо-1-арсената, таким образом предотвращая обратимую реакцию [78]. Необратимость арсенолиза помогает достичь хороших результатов в исследованиях механизма реакции с помощью аналогов комплексов переходного состояния [79].Для ферментов из селезёнки телёнка и эритроцитов человека рентгеноструктурными методами показано существование тройных комплексов фермент/нуклеозид/фосфат и фермент/основание/R-1-P/(сульфат) [75,80,81]. Для комплекса фермента из E. coli также имеются данные о кристаллической структуре фермент/нуклеозид/фосфат(сульфат) [82].…”

“…Для ферментов из селезёнки телёнка и эритроцитов человека рентгеноструктурными методами показано существование тройных комплексов фермент/нуклеозид/фосфат и фермент/основание/R-1-P/(сульфат) [75,80,81]. Для комплекса фермента из E. coli также имеются данные о кристаллической структуре фермент/нуклеозид/фосфат(сульфат) [82].…”