Rapid in vitro microindexing of viroids in citrus

Abstract

A new laboratory technique combining shoot-tip grafting in vitro and biological indexing on indicator plants was explored for the detection of citrus exocortis and related viroids. Τ hree in vitro laboratory methods were used and compared with the classical biological method. With the classical in vivo method, diagnosis is based on the expression of symptoms on indicators 11-14 weeks after inoculation. In contrast, with the first in vitro method, microindexing in vitro of citron seedlings by graft inoculation, diagnosis was possible 12 days after inoculation; with the second method, microindexing in vitro of citron cuttings by graft inoculation, 20 days after inoculation; and with the third method, microindexing in vitro of citron cuttings by injection inoculation, 40 days after inoculation. Inoculated Etrog citron plantlets grown in vitro and tested by RT-PCR showed the same viroid content as the source plants. Of the three in vitro viroid indexing methods, microindexing on cuttings by grafting was easier and more reliable than microindexing either on seedlings or on cuttings by injection.

Caracterización del Viroide exocortis de los cítricos en diferentes condiciones de indexado

“…El desarrollo de síntomas característicos de viroides en plantas de interés económico mediante el uso de cultivo in vitro ha mostrado ser una herramienta eficaz en estudios relacionados con transmisión Mahfouze et al, 2010;Černi et al, 2012) y diagnóstico por indexado (Kapari et al, 2008). Técnicas alternativas al diagnós-tico oficial por indexado que permitan conocer el comportamiento de los viroides en ambientes controlados pueden ser útiles en el desarrollo de diagnósticos oportunos, la prevención de la enfermedad y el establecimiento de medidas de manejo.…”

“…En este estudio solamente se consideró la variable ddi como el momento a partir del cual patógeno y hospedante están en contacto para la expresión de síntomas. Es cierto que el indexado in vitro requiere de tiempo para el desarrollo de los callos que servirán como inóculo, pero existe la posibilidad de utilizar otro tipo de tejido como la corteza de plantas infectadas (Kapari et al, 2008). Además, la presencia de CEVd en brotes y callos cultivados in vitro podría contribuir a desarrollar nuevas líneas de investigación de aspectos relacionados con la patogenicidad de los viroides ya que el cultivo de callo infectado es fácil de conservar y multiplicar y es un tejido útil cuando se requiere homogenizar la muestra.…”

“…El uso de la misma variedad indicadora en ambos indexados indica que la concentración y el tamaño del hospedante entre un indexado y otro (5-30 cm) pudieron ser los principales factores de influencia en el desarrollo de la enfermedad. La rapidez con la que aparecen los síntomas in vitro podría deberse al tiempo que requieren los viroides para replicarse y moverse dentro de la planta inoculada (Kapari et al, 2008). Posiblemente una mayor concentración derivada del tamaño de los brotes (5 cm) con respecto al tamaño de las plantas (30 cm) favoreció el rápido desarrollo de síntomas in vitro en éste estudio.…”

“…This study only considered the variable dai as the moment as of which pathogen and host are in contact for the expression of symptoms. Although it is true that indexing in vitro requires time to develop callus that will act as inoculants, it is possible to use another type of tissue such as the cortex of infected plants (Kapari et al, 2008). Also, the presence of CEVd in sprouts and callus planted in vitro could contribute to develop new lines of research of aspects related to the pathogenicity of the viroids, since infected callus cultures are easy to preserve and multiply, and it is a useful tissue when the sample needs to be homogenized.…”

“…The study of the conditions that affect the development of a disease help predict prediction models, find possible weather conditions related to changes, determine the intensity of the disease, establish management measures to reduce the possible effect of the incidence and severity on the field, or to speed up the disease with diagnosis purposes. The development of characteristic symptoms of viroids in economically important plants using in vitro culture has proven to be an effective tool in transmission-related studies Mahfouze et al, 2010;Černi et al, 2012) and diagnosis by indexing (Kapari et al, 2008). Alternative techniques to the official diagnosis by indexing that help understand the behavior of…”