Rational Design of a Novel Tubulin Inhibitor with a Unique Mechanism of Action

Mühlethaler, Tobias; Milanos, Lampros; Martínez, José Antonio González; Blum, Thorsten B.; Gioia, Dario; Roy, Bibhas; Prota, A.E.; Cavalli, Andrea; Steinmetz, Michel O.

doi:10.1002/ange.202204052

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“…To date, eight binding sites on the tubulin dimer have been identified. MSAs commonly bind to the Paclitaxel site and Laulimalide site (Nogales et al, 1995; Prota, Bargsten, Northcote, et al, 2014), while MDAs typically bind to the Colchicine, Vinblastine, Maytansine, Pironetin, or Todalam sites (Gigant et al, 2005; Mühlethaler et al, 2022; Prota, Bargsten, Diaz, et al, 2014; Ravelli et al, 2004; Yang et al, 2016). Recently, we discovered that Cevipabulin, a synthetic tubulin inhibitor, could simultaneously bind to two different sites on tubulin— Vinblastine site and The Seventh site (previously undefined) (Yang et al, 2021).…”

Section: Introductionmentioning

confidence: 99%

Cevipabulin induced abnormal tubulin protofilaments polymerization by binding to Vinblastine site and The Seventh site

Bai,

Yan,

Yang

2023

Cytoskeleton

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Microtubules, composed of αβ‐tubulin heterodimers, are crucial targets for chemotherapeutic agents and possess eight binding sites. Our previous study identified cevipabulin as the only one agent capable of simultaneously binding to two different sites (Vinblastine site and The Seventh site). Binding to The Seventh site by cevipabulin induces tubulin degradation. This study aimed to investigate whether it is binding to the Vinblastine site and The Seventh site exhibited an interactive cellular effect. Surprisingly, we discovered that cevipabulin induced abnormal tubulin protofilaments polymerization, a previously undefined tubulin morphology, and we proved it was an interactive effect of Cevipabulin's binding to both Vinblastine site and The Seventh site. Immunofluorescence and transmission electron microscopy confirmed cevipabulin induced the formation of linear tubulin protofilaments and their subsequent aggregation into irregular tubulin aggregates. Competition binding assays and the αY224G mutation revealed that binding of cevipabulin to both sites was necessary for the tubulin protofilaments polymerization effect. Moreover, we found that co‐treatment with a microtubule stabilization agent binding the Vinblastine site and a microtubule destabilization agent binding at the intra‐dimer interface of tubulin could also induce similar tubulin protofilaments polymerization. We proposed a mechanism where a microtubule stabilization agent on the Vinblastine site enhances longitudinal interactions between tubulin dimers, while, a microtubule destabilization agent binding at the intra‐dimer interface prevents the adoption of a straight conformation of the tubulin dimer and disrupts lateral interactions between tubulins, consequently leading to tubulin protofilaments polymerization. This study reported a new inhibitor‐induced‐tubulin‐morphology‐change and would provide insight into tubulin dynamic instability and also guide further study of cevipabulin.

show abstract

Section: Introductionmentioning

confidence: 99%

Cevipabulin induced abnormal tubulin protofilaments polymerization by binding to Vinblastine site and The Seventh site

Bai,

Yan,

Yang

2023

Cytoskeleton

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show abstract

“…The gatorbuline and todalam sites are the newest MDA binding sites described on the tubulin heterodimer. Similar to the vinca agents, binding of gatorbuline or todalam is thought to induce a "wedge" in the heterodimer conformation, thereby preventing polymerization [301][302][303]. The gatorbuline site is position next to the colchicine site at the intra-dimer interface.…”

Section: The Effects Of Mtas On the Microtubule Dynamicsmentioning

confidence: 99%

The influence of the microtubule-targeting agent pretubulysin on inflammatory processes of the vascular endothelium

Primke

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Chronische Entzündungen und die daraus resultierenden Morbiditäten gehören zu den häufigsten Ursachen für einen frühen Tod beim Menschen. Einer der Hauptfaktoren für die Verschlechterung des Gesundheitszustands bei Patienten mit chronischen-entzündlichen Erkrankungen ist die pathologische Infiltration von Leukozyten in gesundes Gewebe, die zu Gewebeschäden und dem Fortschreiten der Krankheit führt. Das vaskuläre Endothel, das die Innenseite der Blutgefäße auskleidet, spielt eine entscheidende Rolle bei der Entzündungsreaktion, da es als Schnittstelle für die Interaktion mit Leukozyten fungiert, um die Extravasation von Leukozyten aus dem Blutstrom in das Gewebe zu ermöglichen. Die Adhäsion von Leukozyten an die Zellen des Endothels wird dabei hauptsächlich durch die von Zytokinen ausgelösten pro-inflammatorischen NFκB- und AP-1-Signalkaskaden ermöglicht, die die Hochregulierung der wichtigsten endothelialen Adhäsionsmoleküle – ICAM-1, VCAM-1 und E-Selektin – bewirken. Eine Klasse von Wirkstoffen, die für ihre entzündungshemmenden Eigenschaften und ihren Nutzen bei der Behandlung chronischer Entzündungskrankheiten bekannt sind, sind die Mikrotubuli-bindenden-Substanzen (microtubule-targeting-agents; MTAs), die nachweislich auch den Entzündungszustand in den Zellen des Endothels und die Leukozyten-Adhäsionskaskade beeinflussen können. MTAs lassen sich in Mikrotubuli-Destabilisatoren, die eine Depolymerisation des Mikrotubuli-Zytoskeletts bewirken, und Mikrotubuli-Stabilisatoren, die die Depolymerisation der Mikrotubuli verhindern, unterteilen. Die zugrundeliegenden biomolekularen Vorgänge und Wirkungen, die die MTAs auf die Zellen des Gefäßendothels haben, und wie sie die Adhäsionskaskade der Leukozyten beeinflussen, sind jedoch weitgehend unbekannt. Ziel dieser Studie war es, die Auswirkungen des neuartigen Mikrotubuli-Destabilisators Prätubulysin, eines Vorläufers der Tubulysine, die ursprünglich in Stämmen des Myxobakteriums Angiococcus disciformis entdeckt wurden, auf die entzündlichen Prozesse zu untersuchen, die die Leukozyten-adhäsion in TNF-aktivierten primären Endothelzellen aus der menschlichen Nabelschnurvene (HUVECs) ermöglichen. Zusätzlich wurden auch die Auswirkungen der bereits klinisch etablierten Mikrotubuli-Destabilisatoren Colchicin und Vincristin sowie des Mikrotubuli-Stabilisators Paclitaxel untersucht. Das entzündungshemmende Potenzial von Prätubulysin wurde daher zunächst in vivo in einem Imiquimod-induzierten psoriasiformen Dermatitis-Mausmodell getestet, wobei sich zeigte, dass Prätubulysin den Entzündungszustand deutlich verringert. Um zu beweisen, dass der entzündungshemmende Effekt mit einer verringerten Interaktion von Leukozyten mit dem Endothel zusammenhängt, wurde die Wirkung von Prätubulysin in vivo mittels Intravitalmikroskopie des TNF-aktivierten Kremaster-Muskels der Maus untersucht. Dabei zeigte sich, dass die Behandlung mit Prätubulysin zu einer signifikant verringerten Adhäsion von Leukozyten an die Zellen des Gefäßendothels führte. Die verringerte Adhäsion von Leukozyten an Endothelzellen wurde auch in der in vitro Umgebung bestätigt, indem die Adhäsion von Leukozyten unter Flussbedingungen getestet wurde. Mittels Durchflusszytometrie, Western-Blot-Analyse, sowie qRT-PCR-Analyse der jeweiligen mRNA-Level konnte gezeigt werden, dass die verringerten Leukozyten-Interaktionen auf der verringerten Expression der Zelladhäsionsmoleküle ICAM-1 und VCAM-1 sowie teilweise von E-Selektin nach Behandlung mit Prätubulysin, Vincristin und Colchicin beruhen, wobei Paclitaxel keine signifikanten hemmenden Auswirkungen hatte. Weitere Untersuchungen des Einflusses von Prätubulysin auf die NFκB- und AP-1-Signalübertragung zeigten, dass diese intrazellulären Signalkaskaden durch Prätubulysin nicht behindert werden, wobei NFκB und AP-1 weitgehend in den Promotoren der Zelladhäsionsmoleküle angereichert waren, wie durch Chromatin-Immunpräzipitation nachgewiesen wurde. Darüber hinaus induzierte die Behandlung mit Prätubulysin die Aktivität der NFκB-induzierenden Kinase IKK und führte zu einem signifikanten Anstieg der Aktivität der AP-1 Upstream-Kinase JNK, wie eine Western Blot Analyse ergab. Die Prüfung der Transkriptionsaktivität von NFκB und AP-1 in Reportergen Assays zeigte, dass insbesondere die Mikrotubuli-Destabilisatoren die Promotoraktivität dieser Transkriptionsfaktoren in einer konzentrationsabhängigen Weise verringerten. Weitere Tests zur Abhängigkeit der durch Prätubulysin induzierten Hemmung der Zelladhäsionsmoleküle von der Aktivität der JNK zeigten, dass die Hemmung empfindlich auf die Aktivität dieser Kinase reagiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Inhibition der Aktivität der JNK die Expression der Zelladhäsionsmoleküle durch die Behandlung mit Prätubulysin auf mRNA und Proteinebene wiederherstellt. Mit Hilfe der Chromatin-Immunpräzipitation konnte weiterhin gezeigt werden, dass die Behandlung mit Prätubulysin zunächst die Assoziation des Bromodomänen-enthaltenden Proteins 4 mit den Promotoren/Genen von ICAM-1 und VCAM-1 erhöhte, aber zu einem behandlungszeitabhängigen Rückgang der Anreicherung führte. Darüber hinaus wurde durch die Behandlung mit Prätubulysin auch der Abbau dieses Proteins leicht erhöht. Durch den Einsatz eines JNK Inhibitors konnte gezeigt werden, dass die Verdrängung des Bromodomänen-enthaltenden Proteins 4 von icam-1 und vcam-1, sowie der erhöhte Abbau dieses Faktors auch von der Aktivität der JNK abhängig sind. Die Verdrängung des Bromodomänen-enthaltenden Proteins 4 induzierte auch das Vorhandensein von repressiven Chromatinmarkierungen in den Genen von ICAM-1 und VCAM-1. Die Prüfung der Anreicherung der RNA-Polymerase II an den Promotoren/Genen von ICAM-1 und VCAM-1 zeigte jedoch auch eine behandlungszeitabhängige differentielle Anreicherung dieser Polymerase, wobei die Anreicherung nach kurzen Behandlungszeiten reduziert war, sich nach mittleren Behandlungszeiten erholte und nach längeren Behandlungszeiten wieder stark reduziert war. Die anschließende Prüfung der Bedeutung des Bromodomänen-enthaltenden Proteins 4 für die Expression von ICAM-1 und VCAM-1 durch Knock-down-Experimente ergab, dass das vcam-1 Gen durch Knock-down dieses Proteins unterdrückt, das icam-1 Gen jedoch induziert wird. Dies deutet auf das Vorhandensein zusätzlicher Faktoren hin, die auch auf die Aktivität der JNK reagieren und neben dem Bromodomänen-enthaltenden Proteins 4 die Transkriptionsverlängerung des icam-1 Gens bewirken.

show abstract

The cytotoxic natural compound erianin binds to colchicine site of β-tubulin and overcomes taxane resistance

Yan,

Zhou,

Yuan

et al. 2024

Bioorganic Chemistry

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Rational Design of a Novel Tubulin Inhibitor with a Unique Mechanism of Action

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Cevipabulin induced abnormal tubulin protofilaments polymerization by binding to Vinblastine site and The Seventh site

Cevipabulin induced abnormal tubulin protofilaments polymerization by binding to Vinblastine site and The Seventh site

The influence of the microtubule-targeting agent pretubulysin on inflammatory processes of the vascular endothelium

The cytotoxic natural compound erianin binds to colchicine site of β-tubulin and overcomes taxane resistance

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