Introdução: A falta de informação sobre biossegurança e comportamento em ambiente de internação para familiares cuidadores de pacientes pediátricos pode contribuir para aumentar os riscos de contaminação acidental em ambiente hospitalar. Objetivo: Descrever a percepção de familiares cuidadores de pacientes pediátricos sobre biossegurança e comportamento em ambiente hospitalar. Metodologia: Estudo prospectivo, descritivo com abordagem quantitativa onde a coleta de dados se deu através de testes escritos, antes e após orientações in locu, ou seja, beira leito, para avaliar o conhecimento destes sobre biossegurança e comportamento em ambiente de internação. Resultados: No período foram entrevistados 104 familiares cuidadores, sendo que 39 (37,5%) eram acompanhantes de pacientes com doenças infecto contagiosas já com tratamento em curso e 65 (62,5%) da clínica para pacientes pediátricos em investigação por apresentarem síndrome respiratória aguda grave-SRAG. Esses familiares cuidadores tinham idade entre 18 a 60 anos com ensino médio completo (64,6%). Um número bem expressivo deles (70,7%) eram mães dos pacientes e 15,5% informou que tinham apenas o cônjuge como apoio para realização de permutas/trocas. A Zona Norte da cidade de Manaus foi o endereço onde a maioria (26,2%) morava. Um grande número dos entrevistados (60,5%) não tinham entendimento sobre regras de biossegurança e que a maior dúvida era o motivo pelo qual não podiam colocar seu paciente no berço de outra criança (34,6%). Após treinamento houve 100% de acerto em todas os questionamentos relacionados a biossegurança e comportamento em ambiente hospitalar. Conclusão: toda e qualquer exposição desnecessária a riscos existentes em ambiente hospitalar é amenizada na presença de orientações.