Las especies del género Agave se usan para obtener fibras y azúcares. En Oaxaca, México, hay 10 mil hectáreas cultivadas con diversas especies de este género, y 80 % de esta área es cultivada con A. angustifolia Haw. Las plantaciones se establecen con plantas propagadas asexualmente, provenientes de estructuras como vástagos de rizomas, bulbilos de inflorescencias y plantas obtenidas mediante micropropagación. El ambiente de cultivo in vitro afecta las características fisiológicas y morfológicas de las plantas micropropagadas y su adaptación a las condiciones ex vitro. El objetivo de este estudio fue determinar la influencia del ambiente de incubación y del sustrato utilizado para la aclimatación de las plantas de A. angustifolia obtenidas in vitro sobre su supervivencia, características morfológicas y crecimiento. Brotes adventicios se enraizaron en laboratorio con iluminación LED. Las plantas regeneradas se cultivaron durante 31 días en dos ambientes de incubación, laboratorio con iluminación LED o estructura de sombra parcial. Para su aclimatación, las plantas se transfirieron a sustratos que contenían turba (T) y perlita (P) en proporciones 50T:50P, 25T:75P y 0T:100P, permaneciendo durante 65 días dentro una estructura con sombra parcial y 30 días en un vivero. Después de 65 días de aclimatación, 100 % de las plantas provenientes tanto de los cultivos in vitro, incubados tanto en la estructura de sombra parcial como en el laboratorio, sobrevivieron cuando se establecieron en el sustrato 50T:50P. Al término de la aclimatación, las plantas originadas de cultivos incubados en la estructura de sombra parcial, que crecieron en el sustrato 0T:100P, tuvieron mayor diámetro de tallo, número de raíces, volumen de raíces, peso seco aéreo y de raíz, y menor altura, número de hojas y área foliar que las plantas provenientes de cultivos in vitro incubados en el laboratorio.