Regulation of aldehyde dehydrogenases by nuclear receptors CAR and PXR in rats genetically predetermined in response to phenobarbital

Abstract

H σπουδαιότητα των ενζύμων που ανήκουν στην υπερ-οικογένεια των αλδεϋδικών αφυδρογονασών (ALDHs) στην ευζωία των οργανισμών και κυρίως στην προστασία τους από ξενοβιοτικούς παράγοντες, καθώς και η συσσώρευση στοιχείων που υποδηλώνουν την εμπλοκή πυρηνικών υποδοχέων στην ρύθμιση της έκφρασης πολλών γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων τωναλδεϋδικών αφυδρογονασών, κέντρισε το ενδιαφέρον μας να αποκαλύψουμε τον πιθανό ρόλο των υποδοχέων CAR και PXR στην επαγωγή/ρύθμιση των ALDHs της υπο-οικογένειας 1Α, αξιοποιώντας το ιδιαίτερο πειραματικό μοντέλο των επίμυων του γένους Wistar/Af/Han/Mol/Kuo/Io. Συγκεκριμένα, ταδυο στελέχη των επίμυων που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη χαρακτηρίζονται ως αποκρινόμενα (RR) ή μη-αποκρινόμενα (rr) ως προς την επαγωγή των γονιδίων ALDH1A, μετά την χορήγηση φαινοβαρβιτάλης (ΡΒ) ή άλλων ΡΒ τύπου επαγωγέων. H προφανής διαφορά στην επαγωγή των ALDH1As μεταξύ των δύο στελεχών, που ανιχνεύτηκε με πειράματα μελέτης των πρωτεϊνών, τόσο σε βασικά επίπεδα έκφρασης όσο και μετά τηχορήγηση φαινοβαρβιτάλης (PB) ή καρβονιτριλίου της πρεγνενολόνης (PCN), διερευνήθηκε περαιτέρω με μελέτη των επιπέδων παραγωγής mRNA. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι η αξιοσημείωτη διαφορά οφείλεται στην παντελή έλλειψη έκφρασης του γονιδίου ALDH1A7 στο στέλεχος rr. Επίσης,παρατηρήθηκε εντυπωσιακή αυξο-ρύθμιση στους RR επίμυες, ιδιαίτερα παρουσία των παραπάνω φαρμάκων, τα οποία δρουν ως εκλεκτικοί αγωνιστές των πυρηνικών υποδοχέων CAR και PXR.Παράλληλα, η έκφραση του γονιδίου ALDH1A1 βρέθηκε λίγο υψηλότερη στους rr επίμυες, συγκριτικά με τα αντίστοιχα επίπεδα στο RR στέλεχος. Αποτελέσματα που υποστηρίζουν τα παραπάνω στοιχεία προέκυψαν και από πειράματα οντογένεσης που πραγματοποιήθηκαν σε ήπαρ από νεογέννητους επίμυες, αλλά και σε αντίστοιχη in vitro μελέτη πρωτογενών καλλιεργειών ηπατοκυττάρων. Η μετακίνηση των υποδοχέων CAR και PXR στον πυρήνα των κυττάρων, μετά την χορήγηση των εκλεκτικών αγωνιστών τους ήταν εμφανής και στα δύο στελέχη των επίμυων, και επίσης ήταν χρονο- και δόσο-εξαρτώμενη. Ωστόσο, η ικανότητά τους να ενεργοποιούν την έκφραση γονιδίων μελετήθηκε περαιτέρω, με μέτρηση της επαγωγής γνωστών γονιδίων στόχων τους: των κυτοχρωμάτωνCYP2B1 και CYP3A1, αντίστοιχα.Εστιάζοντας στην σημαντικά υψηλή διαφορά μεταξύ των δύο στελεχών ως προς την έκφραση της ALDH1A7 και την αδιαμφισβήτητη επίδραση των παραπάνω φαρμάκων στην ρύθμιση της έκφρασης, πραγματοποιήσαμε δοκιμασίες μέτρησης γονιδίου αναφοράς, χρησιμοποιώντας διάφορα τμήματα των υποκινητών του γονιδίου, προερχόμενα από τα δύο στελέχη (RR-ALDH1A7 και rrALDH1A7).Επιπλέον, πραγματοποιήθηκαν δοκιμασίες ανοσοκαθίζησης της χρωματίνης στα παραπάνω τμήματα των υποκινητών. Ιδιαίτερα ενδιαφέρον ήταν το εύρημα ότι ο υποκινητής RRALDH1A7 είναι ενεργός και μάλιστα η ενεργότητά του αυξάνεται δραστικά σε περίπτωση χορήγησης ΡΒ, γεγονός το οποίο είναι σε πλήρη αντίθεση με την ελάχιστη ενεργότητα που επέδειξε ο υποκινητής rr-ALDH1A7. Παρ’ όλο που ο η περιοχή του υποκινητή που βρίσκεται κοντά στην αρχή του γονιδίου είναι η πιο σημαντική για την ενεργοποίηση της έκφρασης, βρέθηκε ότι η περιοχή του υποκινητή RRALDH1A7 που βρίσκεται μεταξύ -1566 και -452 είναι υπεύθυνη για την μέγιστη ενεργότητα. O πυρηνικός υποδοχέας CAR αναδεικνύεται ως κύριος ρυθμιστής της έκφρασης του γονιδίου RR-ALDH1A7, ιδιαίτερα μετά την χορήγηση PB ή άλλων αγωνιστών του CAR. Ειδικότερα στο γονίδιο RR-ALDH1A7 ο CAR βρέθηκε ότι προσδένενται στον υποκινητή μακριά από την θέση έναρξης της μεταγραφής, δρώντας κυρίως ως ενισχυτής της έκφρασης του γονιδίου, και πιθανότατα και ο PXR να δύναται να προσδεθεί, δεδομένου ότι οι δύο υποδοχείς συχνά ανταλλάσουν τις θέσεις πρόσδεσής τους στα γονίδια-στόχους και αλληλεπιδρούν μεταξύ τους