Sensitivity assessment to azamethiphos by time-to-response bioassay and biomarkers in the sea louse Caligus rogercresseyi

Sáez-Vera, Constanza; Núñez‐Acuña, Gustavo; Gallardo‐Escárate, Cristian

doi:10.1016/j.aquaculture.2021.737340

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“…Interestingly, most of the trypsins identified in this study were differentially expressed after drug exposure and according to resistant or susceptible populations (46 out of 60 genes), supporting the hypothesis of the role of trypsins in delousing drug response and expanding this to azamethiphos, deltamethrin, and cypermethrin. These results also support the hypothesis related to considering trypsin genes as biomarkers for delousing drug susceptibility, which was suggested for C. rogercresseyi in novel bioassays using azamethiphos [36], especially trypsin-2 and trypsin-5, which were also validated by qPCR. In the qPCR validation of these two genes, the basal expression levels were also variable in control samples for both S/R populations (Figure 4).…”

Section: Discussionsupporting

confidence: 85%

“…On the other hand, regarding the luciferase assay, it was possible to validate the trypsin 2-like target site for bantam, which was a technique previously validated for other miRNA-mRNA binding sites [47]. Thus, the regulation of the expression of trypsin-2 by bantam adds more value to the interest for this gene, which has been suggested as a biomarker for drug sensitivity in C. rogercresseyi [36]. Future investigation will be conducted to evaluate gene-miRNA interaction through in vivo assays, and to explore if bantam could reduce the expression of the trypsin-2 gene, altering the molecular response of the sea louse C. rogercresseyi to delousing drugs.…”

Section: Discussionmentioning

confidence: 99%

“…Validation of trypsin gene transcription was conducted on 200 ng of extracted RNA, and cDNA synthesis was performed using the RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis kit (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA). Primers and probes for the trypsin 2 and 5 genes were used as in a previous study [36], including an endogenous control gene b-tubulin to perform a triplex TaqMan ® assay (Table 2; Life Technologies™, Carlsbad, CA, USA). The qPCR reactions consisted of 20 µL of total volume using the Kapa Probe fast qPCR Master Mix 2X kit (Kapa Biosystems, Wilmington, MA, USA) following the default protocol provided by the manufacturer.…”

Section: Gene Expression Validation By Qpcrmentioning

confidence: 99%

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Trypsin Genes Are Regulated through the miRNA Bantam and Associated with Drug Sensitivity in the Sea Louse Caligus rogercresseyi

Núñez‐Acuña

Valenzuela-Muñoz

Carrera-Naipil

et al. 2021

ncRNA

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The role of trypsin genes in pharmacological sensitivity has been described in numerous arthropod species, including the sea louse Caligus rogercresseyi. This ectoparasite species is mainly controlled by xenobiotic drugs in Atlantic salmon farming. However, the post-transcriptional regulation of trypsin genes and the molecular components involved in drug response remain unclear. In particular, the miRNA bantam family has previously been associated with drug response in arthropods and is also found in C. rogercresseyi, showing a high diversity of isomiRs. This study aimed to uncover molecular interactions among trypsin genes and bantam miRNAs in the sea louse C. rogercresseyi in response to delousing drugs. Herein, putative mRNA/miRNA sequences were identified and localized in the C. rogercresseyi genome through genome mapping and blast analyses. Expression analyses were obtained from the mRNA transcriptome and small-RNA libraries from groups with differential sensitivity to three drugs used as anti-sea lice agents: azamethiphos, deltamethrin, and cypermethrin. The validation was conducted by qPCR analyses and luciferase assay of selected bantam and trypsin genes identified from in silico transcript prediction. A total of 60 trypsin genes were identified in the C. rogercresseyi genome, and 39 bantam miRNAs were differentially expressed in response to drug exposure. Notably, expression analyses and correlation among values obtained from trypsin and bantam revealed an opposite trend and potential binding sites with significant ΔG values. The luciferase assay showed a reduction of around 50% in the expression levels of the trypsin 2-like gene, which could imply that this gene is a potential target for bantam. The role of trypsin genes and bantam miRNAs in the pharmacological sensitivity of sea lice and the use of miRNAs as potential markers in these parasites are discussed in this study.

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Section: Discussionsupporting

confidence: 85%

Section: Discussionmentioning

confidence: 99%

Section: Gene Expression Validation By Qpcrmentioning

confidence: 99%

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Trypsin Genes Are Regulated through the miRNA Bantam and Associated with Drug Sensitivity in the Sea Louse Caligus rogercresseyi

Núñez‐Acuña

Valenzuela-Muñoz

Carrera-Naipil

et al. 2021

ncRNA

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“…Currently, the main sea louse control methods are based on delousing drugs such as pyrethroids, organophosphates, and chitin inhibitors [ 52 , 53 ]. However, a reduction in the efficacy of these compounds has already developed in C. rogercresseyi populations [ 54 , 55 , 56 , 57 , 58 ]. Thus, several studies have investigated the underlying mechanisms involved in sea lice response to delousing drugs, suggesting potential resistance mechanisms [ 10 , 11 , 59 , 60 , 61 , 62 ].…”

Section: Introductionmentioning

confidence: 99%

Peritrophin-like Genes Are Associated with Delousing Drug Response and Sensitivity in the Sea Louse Caligus rogercresseyi

Casuso

Núñez‐Acuña

Valenzuela-Muñoz

et al. 2022

IJMS

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Caligus rogercresseyi is the main ectoparasite that affects the salmon industry in Chile. The mechanisms used by the parasite to support its life strategy are of great interest for developing control strategies. Due to the critical role of insect peritrophins in host–parasite interactions and response to pest control drugs, this study aimed to identify and characterize the peritrophin-like genes present in C. rogercresseyi. Moreover, the expression of peritrophin-like genes was evaluated on parasites exposed to delousing drugs such as pyrethroids and azamethiphos. Peritrophin genes were identified by homology analysis among the sea louse transcriptome database and arthropods peritrophin-protein database obtained from GenBank and UniProt. Moreover, the gene loci in the parasite genome were located. Furthermore, peritrophin gene expression levels were evaluated by RNA-Seq analysis in sea louse developmental stages and sea lice exposed to delousing drugs deltamethrin, cypermethrin, and azamethiphos. Seven putative peritrophin-like genes were identified in C. rogercresseyi with high homology with other crustacean peritrophins. Differences in the presence of signal peptides, the number of chitin-binding domains, and the position of conserved cysteines were found. In addition, seven peritrophin-like gene sequences were identified in the C. rogercresseyi genome. Gene expression analysis revealed a stage-dependent expression profile. Notably, differential regulation of peritrophin genes in resistant and susceptible populations to delousing drugs was found. These data are the first report and characterization of peritrophin genes in the sea louse C. rogercresseyi, representing valuable knowledge to understand sea louse biology. Moreover, this study provides evidence for a deeper understanding of the molecular basis of C. rogercresseyi response to delousing drugs.

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“…(Bravo et al, 2013). Estos ectoparásitos han desarrollado mecanismos de resistencia debido al uso constante y excesivo de estos fármacos (Arriagada et al, 2020;Bravo et al, 2015b;Sáez-Vera et al, 2022). Por lo tanto, las vacunas como método de control profiláctico, es una alternativa sustentable para la industria salmonera.…”

Section: Caligidosis Y Sus Métodos De Controlunclassified

Remodelación estructural y funcional en la respuesta transcriptómica de salmón del Atlántico frente a patógenos que afectan a la salmonicultura.

Gallardo Escárate

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La salmonicultura, como una de las actividades económicas más importante en Chile, se enfrenta a desafíos constantes enfrenta desafíos como las enfermedades infecciosas y el impacto ambiental generado por los tratamientos. Dentro de las principales enfermedades que afectan el cultivo del salmón del Atlántico se encuentran la caligidosis y la septicemia rickettsial salmonídea (SRS). El uso de vacunas como estrategia de inmuno-estimulación activa en el salmón del Atlántico, es una solución prometedora para prevenir enfermedades y reducir la contaminación. Comprender cómo el salmón del Atlántico responde a nivel molecular a estos estímulos o a la presencia de patógenos, es crucial para desarrollar estrategias de manejo y control eficaces. En este sentido, la tecnología de secuenciación del transcriptoma de RNA (RNA-seq) ha contribuido en gran medida a comprender los cambios moleculares y funcionales que ocurren en un organismo en presencia de una estimulación, los cuales conllevan a una remodelación estructural y funcional de su respuesta transcriptómica como mecanismo de defensa. En este contexto, la presente tesis doctoral tiene como objetivo evaluar los mecanismos de remodelación transcriptómica, estructural y funcional de la respuesta del salmón del Atlántico frente a diferentes estímulos inmunológicos, ya sean infecciones patógenas o procesos de vacunación. Para ello, se utilizaron diferentes modelos de estudio in vitro e in vivo, para evaluar los diferentes mecanismos potenciales de remodelación de la respuesta inmune de salmón del Atlántico frente a diferentes estímulos inmunomoduladores. Como primera etapa, se comparó la respuesta transcriptómica de la línea celular SHK-1 estimulada con la proteína recombinante Cr-catepsina de Caligus rogercresseyi y el riñón anterior de salmones del Atlántico inyectados con la misma proteína. Los resultados de este estudio evidenciaron una diferenciación entre los perfiles transcriptómicos de ambos modelos de estudio, sin embargó un 24,15% de la respuesta transcriptómica fue compartida, la cual estuvo asociada fundamentalmente a la estimulación con el antígeno. Tanto en las células SHK-1 como en el riñón anterior se identificaron vías enriquecidas relacionadas con el sistema inmune y la transducción de señales en ambos tejidos, destacando la vía de señalización de las MAP quinasas, señalización de receptores tipo Toll, melanogenesis, entre otras. Además, un análisis de expresión de lncRNAs reveló un patrón de transcripción específico para cada modelo, donde los principales lncRNA compartidos se encontraron altamente correlacionados con varios transcritos involucrados en la respuesta inmune, la homeostasis del hierro, la respuesta inflamatoria y la apoptosis, evidenciando una posible remodelación funcional a través de los lncRNA ocasionada por la estimulación la proteína recombinante Cr-catepsina. A su vez, este estudio permitió demostrar que es posible utilizar las líneas celulares para la detección inicial de antígenos para desarrollar vacunas contra el piojo de mar, reduciendo el consumo de tiempo asociado con la selección del antígeno. Como segunda etapa del estudio se exploró la remodelación transcriptómica, basada en el splicing alternativo (AS), de estos dos modelos de estudio frente a una infección con Psicirickettsia salmonis. Para ello, se infectaron las células SHK-1 con la bacteria y se tomaron muestras a los 0, 7- y 14-días después de la infección (dpi) para la secuenciación del transcriptoma. Por otro lado, se utilizaron conjuntos de datos de RNA-Seq de riñones anterior de salmón del Atlántico infectados con la misma cepa de P. salmonis. Para ambos modelos de estudio, el mayor número de eventos de splicing alternativo diferencial (DAS) se observó a los 7 dpi. En células SHK-1 infectadas con P. salmonis se observó una alta presencia de genes DAS relacionados con el metabolismo de nucleótidos, evidenciando la competencia de la bacteria por estos micronutrientes. Por lo cual las células aumentarían su capacidad de producción para suplir el déficit de nucleótidos, donde los procesos de AS jugarían un papel fundamental. Por el contrario, el riñón anterior de salmón exhibió muchos términos GO asociados con la respuesta inmune, indicando la importancia funcional del AS en la remodelación funcional de procesos complejos contra la infección bacteriana. Como tercera etapa de este estudio, se evaluó la respuesta transcriptómica en las células sanguíneas del salmón del Atlántico frente a una vacunación y exposición a dos patógenos marinos, C. rogercresseyi y P. salmonis. Para ello se diseñaron cuatro grupos experimentales que incluyeron la vacunación con la quimera recombinante IpathÒ y dos vacunas comerciales contra P. salmonis: BlueGuard + Livac, BlueGuard + Livac + IpathÒ, IpathÒ y Control (PBS adyuvado). Cada grupo fue expuesto a una infestación con C. rogercresseyi y pasados 25 dpi se infectaron con P. salmonis. Las células sanguíneas de los peces de cada grupo experimental fueron extraídas a los 12 dpi y fueron utilizadas para la secuenciación del transcriptoma. En este trabajo, los patrones globales transcriptómicos de las células sanguíneas de salmón del Atlántico de los cuatro grupos experimentales mostraron niveles de expresión diferenciales. El grupo experimental vacunado con IpathÒ mostró una mayor respuesta transcriptómica en comparación con las vacunas comerciales empleadas. Notoriamente, las anotaciones de los genes diferencialmente expresados (DEGs) compartidos por los tres grupos experimentales mostraron un enriquecimiento de genes relacionados con homeostasis y metabolismo del hierro. Adicionalmente, se analizó el comportamiento de distintas rutas de señalización y su posible remodelación transcriptómica en cada grupo experimental, siendo el grupo vacunado con IpathÒ el más representado en todas las rutas, en términos de DEGs. La vía de señalización de HIF-1 y ferroptosis fueron activadas significativamente, lo cual podría predecir que la vacunación con IpathÒ podría estar regulando una hipoxia por déficit de hierro, o la muerte celular por ferroptosis, que podrían ocurrir en el salmón del Atlántico durante la exposición a C. rogercresseyi y P. salmonis. El presente estudio reveló la remodelación transcriptómica como respuesta a diferentes inmuno-estimulaciones, permitiendo profundizar en los mecanismos moleculares implicados en la respuesta inmune del salmón del Atlántico. Este enfoque permitió explorar en detalle los cambios en la expresión génica y el splicing alternativo que ocurren en diferentes tejidos, proporcionando información valiosa sobre la respuesta inmune adaptativa y la plasticidad del sistema inmunológico del salmón del Atlántico. Además, resalta la importancia de integrar diferentes modelos de estudio para obtener una visión integral de la respuesta inmune en diferentes niveles y contextos. Este trabajo proporciona información valiosa para contribuir al desarrollo de estrategias de manejo de enfermedades en la salmonicultura, incluyendo la identificación de marcadores moleculares de respuesta inmune, la selección de cepas resistentes y el diseño de vacunas más efectivas.

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Sensitivity assessment to azamethiphos by time-to-response bioassay and biomarkers in the sea louse Caligus rogercresseyi

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Trypsin Genes Are Regulated through the miRNA Bantam and Associated with Drug Sensitivity in the Sea Louse Caligus rogercresseyi

Trypsin Genes Are Regulated through the miRNA Bantam and Associated with Drug Sensitivity in the Sea Louse Caligus rogercresseyi

Peritrophin-like Genes Are Associated with Delousing Drug Response and Sensitivity in the Sea Louse Caligus rogercresseyi

Remodelación estructural y funcional en la respuesta transcriptómica de salmón del Atlántico frente a patógenos que afectan a la salmonicultura.

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