Sequential Phosphopeptide Enrichment for Phosphoproteome Analysis of Filamentous Fungi: A Test Case Using Magnaporthe oryzae

Abstract

A number of challenges have to be overcome to identify a complete complement of phosphorylated proteins, the phosphoproteome, from cells and tissues. Phosphorylated proteins are typically of low abundance and moreover, the proportion of phosphorylated sites on a given protein is generally low. The challenge is further compounded when the tissue from which protein can be recovered is limited. Global phosphoproteomics primarily relies on efficient enrichment methods for phosphopeptides involving affinity binding coupled with analysis by fast high-resolution mass spectrometry (MS) and subsequent identification using various software packages. Here, we describe an effective protocol for phosphopeptide enrichment using an Iron-IMAC resin in combination with titanium dioxide (TiO) beads from trypsin digested protein samples of the filamentous fungus Magnaporthe oryzae. Representative protocols for LC-MS/MS analysis and phosphopeptide identification are also described.

Identificación y caracterización de efectores de la vía de las proteínas G heterotriméricas mediada por Pga1 en Penicillium chrysogenum

“…A pesar de los enfoques proteómicos disponibles, la fosfoproteómica ha sido poco utilizada en los hongos filamentosos. Los estudios que existen del tema han sido publicados en los últimos seis años, y se reducen a un limitado número de hongos, incluyendo N. crassa [226,227], S. tritici [228], M. oryzae [229,230,231], A. nidulans [232,233,234], A. flavus [235], A. fumigatus [236,237], B. cinerea [238,239,240], F. graminearum [241,242], Alternaria brassicola [238], P. brasiliensis [243], B. bassiana [244], T. reesei [245] y S. macrospora [246,247]. Estos estudios han revelado resultados interesantes, facilitando la comprensión de los mecanismos de patogenicidad y permitiendo identificar múltiples procesos regulados por la fosforilación de proteínas, incluyendo localización celular, plegamiento de proteínas, transporte de membrana, vías de señalización, respuesta a estrés oxidativo, crecimiento micelial, regulación durante la formación de apresorio, conidiación, metabolismo en conidios, metabolismo de fosfolípidos, autofagia, integridad de la pared celular, biosíntesis de aflatoxinas, disponibilidad de fuentes de carbono, producción de deoxinivalenol, secreción de enzimas hidrolíticas, morfogénesis, inducción de celulasas mediada por luz, osmorregulación, almacenamiento de carbono, tráfico intracelular, citoesqueleto, represión de la fotosíntesis y regulación de genes de celulasas.…”